Use of CRISPR/Cas9-edited HEK293 cells reveals that both conventional and novel protein kinase C isozymes are involved in mGlu5a receptor internalization

doi:10.1016/j.jbc.2022.102466

.2022年10月；298(10):102466.

doi:10.1016/j.jbc.2022.102466。 Epub 2022年9月8日。

CRISPR/Cas9编辑的HEK293细胞的使用表明，传统和新型蛋白激酶C同工酶都参与mGlu_5a级受体内化

杰弗里·范·森滕¹, 托尔·科勒¹, Ee Von Moo先生¹, 索菲·塞尔森¹, 汉斯·布伦·奥斯本²

附属公司

PMID： 36087841
PMCID公司：项目经理9530845
内政部： 2016年10月10日/j.jbc.2022.102466

CRISPR/Cas9编辑的HEK293细胞的使用表明，传统和新型蛋白激酶C同工酶都参与mGlu_5a级受体内化

杰弗里·范·森滕等。生物化学杂志. 2022年10月.

.2022年10月；298(10):102466.

doi:10.1016/j.jbc.2022.102466。 Epub 2022年9月8日。

作者

杰弗里·范·森滕¹, 托尔·科勒¹, Ee Von Moo先生¹, 索菲·塞尔森¹, 汉斯·布伦·奥斯本²

附属公司

¹丹麦哥本哈根大学药物设计与药理学系。
²丹麦哥本哈根大学药物设计和药理学系。电子地址：hbo@sund.ku.dk。

PMID： 36087841
PMCID公司：项目经理9530845
内政部： 2016年10月10日/j.jbc.2022.102466

摘要

蛋白偶联受体（GPCR）的内化可由PKC调节。然而，大多数研究PKC同工酶贡献的工具都有相当大的局限性，包括缺乏选择性。在本研究中，我们构建并鉴定了缺乏传统或新型PKC同工酶（ΔcPKC和ΔnPKC）的人胚胎肾293A（HEK293A）细胞系，并利用这些同工酶研究PKC同功酶在代谢型谷氨酸受体5（mGlu）内化中的作用₅). PKC的直接激活和大鼠mGlu的突变_5a级序号⁹⁰¹，受体C尾部的PKC依赖性磷酸化位点，两者都表明PKC同工酶促进了大约40%的受体内化。尽管如此，我们确定mGlu_5a级cPKCs或nPKCs丢失后，内化没有改变。这表明两类同工酶都参与其中，弥补了另一类的缺失，从而实现了不必要的功能。此外，使用Gαq/11抑制剂YM-254890、GPCR激酶2和3（GRK2和GRK3）KO细胞以及包含突变的假定衔接蛋白复合物2（AP-2）相互作用基序的受体，我们证明大鼠mGlu的内化_5a级由Gαq/11蛋白（77%的应答）、GRK2（27%）和AP-2（29%）介导，但不由GRK3介导。我们的PKC-KO细胞系扩展了可用于研究GPCR药理学的KO HEK293A细胞系。此外，由于研究PKC同工酶的药理学工具通常缺乏特异性和/或效力，我们将PKC KO细胞系作为更具体的研究工具来研究PKC介导的细胞生物学方面。

关键词：CRISPR/cas；G蛋白偶联受体；PKC；mGlu5；代谢型谷氨酸受体；受体内吞；受体内化；受体调节。

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数字

图1
**描绘mGlu**_5a级**受体内化。**A类，微克葡萄糖_5a级用喹喹酯刺激受体或用PDBu刺激PKC后受体内化。在添加激动剂后的120分钟内测量内化。在内化测量期间，Agonists在场。B，抑制mGlu_5a级在与1μM Gα预孵育30分钟后，由10μM喹喹酯刺激的受体内化_{2011年第2季度}蛋白抑制剂YM-254890。内化是在对等增加后的6600万年间进行的。C类，mGlu内化_5a级受体Ser⁹⁰¹Ala（S901A）和Tyr¹¹⁵⁶丙氨酸/赖氨酸¹¹⁵⁹Ala（Y1156A，L1159A）突变体对10μM二喹酯和(天)与WT受体相比，它们的表面表达。内化是在对等增加后的6600万年间进行的。E类，mGlu内化_5a级响应10μM quisqualate和(F类)与亲代HEK293A细胞相比，缺乏GRK2或GRK3的HEK293A细胞中的受体表面表达。在添加奎斯夸特后的66分钟内测量内化。数据表示在HEK293A细胞中加入激动剂后0至120分钟（a）或0至66分钟（B+C+E）时间间隔内实时内化测量曲线下面积的平均值和S.E.M.（图S1）从三个（B+C（Y1156A，L1159A）+E）、四个（A）或五个（C（S901A））独立实验中减去缓冲反应，然后将其归一化为受体激动剂反应，共进行三次。数据表示三次（D（Y1156A，L1159A）+F）或五次（D，S901A）独立实验的平均值和S.E.M。未显示的误差线位于符号的尺寸范围内。纳秒第页≥ 0.05, ∗第页 < 0.05, ∗∗第页 < 0.01, ∗∗∗第页<0.001，通过配对确定t吨用Holm-Sidak的多重比较检验进行检验（B）或单因素方差分析(C类–F类)未经处理的WT受体（C+D）原始数据(B)或HEK293A电池（E+F）作为控制条件。mGlu5，代谢型谷氨酸受体5；PDBu，佛波醇12,13-二丁酯。

图2
**PKC-KO HEK293A细胞的产生。**A类，PKC子类之间结构差异的示意图。cPKC和nPKC是DAG传感器，而只有cPKC响应Ca²⁺.aPKC同工酶对这些第二信使不敏感。B，qPCR介导的评估*PRKC公司*HEK293A细胞中的基因转录。C类与未修饰的HEK293A细胞相比，转基因HEK293AΔcPKC和HEK293 AΔnPKC中PKC蛋白水平归一化为GAPDH家庭蛋白的代表性Western blot图像和定量。在HEK293A细胞中未检测到PKCβ和PKCγ蛋白。数据表示在(B)重复或(C类)独特。纳秒第页≥ 0.05, ∗∗第页 < 0.01, ∗∗∗第页<0.001，与参考值34（B）和100（C）相比，使用一个样本t检验确定。cPKC，常规PKC；新型PKC；aPKC，非典型PKC；DAG，二酰甘油。

图3
**用于评估细胞PKC活性的PKC-c1b生物传感器的特性。**A类mGlu刺激后PKC活化的动力学痕迹_5a级-用PDBu、离子霉素或喹喹酯（各10μM）表达HEK293A细胞。指出了PDBu-和等效诱导峰值响应的单点测量所选择的间隔。B，mGlu中依赖浓度的PKC激活_5a级-PDBu和quisqualate表达HEK293A细胞，但不表达4α-PMA。细胞反应归一化为E_最大值PDBu的。C类，微克葡萄糖_5a级-表达细胞用300 nM YM-254890处理30分钟，然后用10μM PDBu或10μM喹喹酯刺激。细胞反应归一化为E_最大值载体处理细胞中各自的激动剂。微克葡萄糖_5a级-在用10μM PDBu刺激表达细胞之前，用浓度系列的小分子PKC抑制剂处理表达细胞30分钟(天)或10μM等效(E类). 细胞反应归一化为E_最大值载体处理细胞中各自的激动剂。PKC生物传感器经处理后生物发光信号的评价(F类)YM-254890或(*G公司*)PKC抑制剂。数据显示了在硅酸盐中进行的三个独立实验的代表性动力学轨迹(A类)或三的平均值和S.E.M(B–F类)或六个(B，PDBu）进行两次（D+E+G）或三次（B+C+F）的独立实验。纳秒第页≥ 0.05, ∗∗∗第页<0.001，通过Holm-Sidak对原始数据的单因素方差分析（ANOVA）和与对照条件相同的激动剂刺激的经载体处理的HEK293A细胞的多重比较测试确定。微克葡萄糖₅代谢型谷氨酸受体5；PDBu，佛波醇12,13-二丁酯。

图4
**评估PKC-c1b生物传感器对单个PKC同工酶激活的敏感性。**PKC-FLAG同工酶表达(A类)、HA-mGlu_5a级表达式(B)和PKC活动(C类)在与单个PRKC基因和mGlu共同转染的HEK293A细胞中_5a级. The灰色，紫色、和*红色虚线*分别表示具有内源性PKC表达的对照HEK293A细胞中基础、喹喹酯和PDBu诱导的PKC活性水平。数据表示3或6的平均值和S.E.M(C类，车辆刺激）重复进行独立实验(C类)或一式三份（A+B）。纳秒第页≥ 0.05, ∗第页 < 0.05, ∗∗第页 < 0.01, ∗∗∗第页<0.001，使用单向方差分析（A+B）或双向方差分析确定(C类)根据与对照条件相同的激动剂刺激的模拟转染HEK293A细胞的原始数据，采用Holm-Sidak的多重比较试验。微克葡萄糖₅代谢型谷氨酸受体5；PDBu，佛波醇12,13-二丁酯。

图5
**缺乏cPKC或nPKC的HEK293A细胞中的PKC活性。**使用PKC-c1b传感器监测细胞PKC活性。微克葡萄糖_5a级受体表达(A类)，PKC传感器的基本活性(B)和10μM离子霉素(C类)、10μM PDBu-和10μM等效物-(天)与HEK293A细胞相比，HEK293AΔcPKC和HEK293 AΔnPKC细胞中诱导的PKC活性。C类在扣除相应的缓冲反应后，通过取60s实时PKC活性曲线下的面积来确定离子霉素诱导的反应，并将其归一化为HEK293A细胞中的离子霉素反应。(B +天)通过在PKC活性峰值处进行单点测量，减去相应的缓冲响应，并将其归一化为E，从而获得基础、PDBu-和等质量诱导的反应_最大值HEK293A细胞中的同一激动剂。数据表示至少三个独立实验的平均值和S.E.M，一式三份。纳秒第页≥ 0.05, ∗第页 < 0.05, ∗∗∗第页<0.001，采用单向方差分析和Holm-Sidak对原始数据的多重比较测试，以HEK293A细胞作为对照条件。微克葡萄糖₅，代谢型谷氨酸受体5；cPKC，常规PKC；新型PKC；PDBu，佛波醇12,13-二丁酯。

图6
**微克葡萄糖**_5a级**亲代、ΔcPKC和ΔnPKC HEK293A细胞的内化和信号转导。**奎方酸诱导的mGlu_5a级内化(A类)和相应的受体表达(B)在HEK293AΔcPKC和HEK293AΔnPKC细胞中，与HEK295A细胞相比。在添加激动剂后的120分钟内测量内化。在内化测量期间，Agonists在场。通过获取实时内化轨迹曲线下的面积、减去缓冲响应并将E归一化来量化内化_最大值在HEK293A细胞中获得。奎方酸诱导的mGlu_5a级-中介IP₁堆积(C类)和相应的受体表达(天)在HEK293AΔcPKC和HEK293AΔnPKC细胞中，与HEK295A细胞相比。减去终点测量值，并将其归一化为E_最大值在HEK293A细胞中获得。奎方酸诱导的mGlu_5a级-介导钙²⁺动员(E类)和相应的受体表达(F类)在HEK293AΔcPKC和HEK293AΔnPKC细胞中，与HEK295A细胞相比。车辆减去最大ΔFluo-4荧光信号，并将其归一化为E_最大值在HEK293A细胞中获得。数据表示三者的平均值和S.E.M(A类–天)和两个（E+F）独立实验，一式三份。纳秒第页≥0.05，以HEK293A细胞为对照条件，采用Holm-Sidak对原始数据进行多重比较试验的单向方差分析确定。cPKC，常规PKC；IP（IP）_1,肌醇单磷酸1；新型PKC；微克葡萄糖₅，代谢型谷氨酸受体5。

图7
**mGlu特性的示意图概述**_5a级**-介导的PKC活化和mGlu**_5a级**内部化。**用于调节细胞PKC活性的研究工具(A类)和mGlu_5a级受体内化(B)在HEK293A电池中。6976; 哥伦布6976、6983；爱荷华州哥尔6983；离子霉素，奎斯；quisqualate，YM；YM-254890；微克葡萄糖₅，代谢型谷氨酸受体5。

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