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.2022年6月1日；21(6):859-870.
doi:10.1158/1535-7163.MCT-21-0934。

一类新型选择性ATM抑制剂作为DNA双链断裂诱导癌症治疗的联合伙伴

阿斯特里德·齐默尔曼 1, 弗兰克·T·曾克 1, 李亚秋 2, 黑科·达门 1, 乌尔里希·佩尔 三, 托马斯·福克斯 4, 托马斯·格隆巴赫 5, 比阿特丽克斯·布鲁姆 三, 柳波米尔·瓦西列夫 2, 安德烈·布劳卡特 1
附属公司

一类新型选择性ATM抑制剂作为DNA双链断裂诱导癌症治疗的联合伙伴

阿斯特里德·齐默尔曼等人。 摩尔癌症治疗. .

摘要

放射治疗和化学DNA损伤剂是当今最广泛使用的癌症治疗药物。如果不进行修复，许多这些治疗方法引起的双品牌断裂（DSB）对癌细胞是致命的。共济失调毛细血管扩张突变（ATM）激酶通过驱动DSB修复和细胞周期检查点来保护癌细胞，在DNA损伤反应中发挥关键作用。ATM催化活性抑制剂已被证明可以抑制DSB DNA修复，阻断检查点控制，并增强放射治疗和其他DSB诱导方式的治疗效果。在这里，我们描述了来自新化学类别M3541和M4076的两种高效选择性ATM抑制剂的药理活性。在生化分析中，它们以亚纳米摩尔的效力抑制ATM激酶活性，并对其他蛋白激酶表现出显著的选择性。在癌细胞中，ATM抑制剂抑制DSB修复、克隆原癌细胞生长，并增强癌细胞系中电离辐射的抗肿瘤活性。将M3541和M4076口服给携带人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠，并采用临床相关的放射治疗方案，可显著增强抗肿瘤活性，导致肿瘤完全消退。疗效与抑制异种移植组织中ATM活性及其下游靶点的调节有关。体外和体内实验表明，PARP和拓扑异构酶I抑制剂具有很强的结合潜力。M4076目前正在进行临床研究。

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数字

无
图形摘要
图1。M3541是ATM激酶活性的有效和选择性抑制剂。A、 M3541结构式、体外ATM激酶分析中的浓度-反应关系以及效力和选择性总结。列出了ATM激酶和PI3K相关激酶密切相关成员的IC50值数据。ATP浓度在KM或KM附近的激酶分析标记为（*）。B、 M3541抑制ATM信令。A549细胞用增加浓度的M3541预处理1小时，并暴露于IR（5 Gy）。在IR和p-ATM后1小时收集全细胞裂解物，并通过Western blotting分析其下游靶点pKAP1、pCHK2和pp53。C、 GE Imager使用ImageJ软件对不同M3541浓度下western blot图像（B）中的pATM水平进行量化，并绘制为IR诱导的p-ATM百分比（100%）。虚线表示未感应p-ATM电平。D、 M3541对ATM野生型（A375、A549、FaDu、HCC1187、HT29、MCF-7、NCI-H460和SW620）和ATM突变癌细胞系（Granta-519、HT-144、NCI-H1395和NCI-H23）中ATM信号的抑制。在辐射模拟博莱霉素（10μmol/L）存在下，用增加M3541浓度的方法处理细胞3-6小时。通过ELISA测定全细胞裂解液中的P-CHK2（Thr68），并计算IC50值。
图1。
M3541是ATM激酶活性的有效和选择性抑制剂。A、，M3541结构式，浓度-反应关系在体外ATM激酶分析和效价和选择性总结。IC50列出了ATM激酶和PI3K相关激酶密切相关成员的值数据。ATP浓度在KM或KM附近的激酶分析标记为（*）。B、，M3541抑制ATM信令。A549细胞用增加浓度的M3541预处理1小时，并暴露于IR（5 Gy）。在IR和p-ATM后1小时收集全细胞裂解物，并通过Western blotting分析其下游靶点pKAP1、pCHK2和pp53。C、，GE Imager使用ImageJ软件对不同M3541浓度下western blot图像（B）中的pATM水平进行量化，并绘制为IR诱导的p-ATM百分比（100%）。虚线表示未产生的p-ATM电平。D、，M3541对ATM野生型（A375、A549、FaDu、HCC1187、HT29、MCF-7、NCI-H460和SW620）和ATM突变癌细胞系（Granta-519、HT-144、NCI-H1395和NCI-H23）中ATM信号的抑制。在辐射模拟博莱霉素（10μmol/L）存在下，增加M3541浓度处理细胞3-6小时。P-CHK2（Thr68)通过ELISA测定全细胞裂解物和IC50计算值。
图2。M3541选择性抑制DSB修复并使癌细胞对放射治疗敏感。A、 M3541抑制IR诱导的ATM信令。在5Gy IR前用1μmol/L M3541预处理A549细胞。6小时后，制备全细胞裂解物，并通过Western blotting评估ATM和ATM通路靶点。B、 M3541抑制IR诱导的DSB修复。如前（A）所述处理A549细胞，红外24小时后用免疫荧光法检测γH2AX病灶。典型图像以×20倍放大显示。γH2AX病灶呈绿色，DAPI核染色呈蓝色。C、 使用ImageJ软件量化B中显示的γH2AX病灶。D、 M3541抑制A549细胞的生长。通过培养活细胞成像（每2小时拍摄一次图像，持续6天），生成（A）中处理的A549核细胞的生长/存活曲线。绿色荧光核的数量代表细胞总数（平均值±SEM）。E、 M3541与IR结合后，会破坏细胞周期进程。DMSO、M3541、IR或IR+M3541处理的A549细胞在不同时间点的细胞周期曲线。F、 M3541抑制克隆形成细胞生长。用不同剂量的IR+/-1μmol/L M3541激发A549细胞，在37°C下培养14天。用0.5%结晶紫染色观察细胞集落，成像并定量。G、 对（F）中所示的相对于DMSO对照组的菌落生长进行量化，并绘制成IR剂量的函数。H、 采用硫罗丹明B（SRB）染色法对79个癌细胞系对M3541单独或与IR（3Gy）联合作用的细胞生长/活性进行定量。协同作用得分通过Bliss exceptive方法计算，如前面的材料和方法中所述，细胞系按字母顺序绘制。一、 单独IR组和IR+M3541组计算的协同得分的方框图表示。
图2。
M3541选择性抑制DSB修复并使癌细胞对放射治疗敏感。A、，M3541抑制IR诱导的ATM信令。在5Gy IR前用1μmol/L M3541预处理A549细胞。6小时后，制备全细胞裂解物，并通过Western印迹评估ATM和ATM途径靶点。B、，M3541抑制IR诱导的DSB修复。A549细胞按照上文所述进行处理(A类)红外24小时后用免疫荧光法检测γH2AX病灶。γH2AX病灶呈绿色，DAPI核染色呈蓝色。C、，γH2AX病灶的量化如所示B类使用ImageJ软件。D、，M3541抑制A549细胞的生长。A549核细胞的生长/存活曲线(A类)通过IncuCyte活细胞成像生成（每2小时拍摄一次图像，持续6天）。绿色荧光核的数量代表细胞总数（平均值±SEM）。E、，M3541与IR结合后，会破坏细胞周期进程。用DMSO、M3541、IR或IR+M3541处理的A549细胞在不同时间点的细胞周期谱。F、，M3541抑制克隆形成细胞生长。用不同剂量的IR+/-1μmol/L M3541激发A549细胞，在37°C下培养14天。用0.5%结晶紫染色观察细胞集落，成像并定量。G、，相对于DMSO控制的菌落增长如所示(如果)作为红外剂量的函数进行量化和绘制。H、，采用硫罗丹明B（SRB）染色法对79个癌细胞系对M3541单独或与IR（3Gy）联合作用的细胞生长/活性进行定量。协同作用得分通过Bliss exceptive方法计算，如前面的材料和方法中所述，细胞系按字母顺序绘制。我，单独IR组和IR+M3541组计算的协同得分的方框图表示。
图3。M3541增强了人类肿瘤异种移植模型的IR疗效。A、 M3541抑制体内ATM下游磷酸化靶点p-CHK2。测量pCHK2（Thr68）调制对IR（黑色）或与IR+M3541（红色）组合的响应。FaDu异种移植荷瘤小鼠（每个治疗组和时间点5只小鼠）接受2 Gy IR的单次治疗，同时服用或不服用100 mg/kg M3541。在IR前10分钟口服M3541。在指定的时间点测量肿瘤裂解液中的pCHK2调制。测定并绘制M3541的血浆浓度（绿色）。B、 M3541剂量依赖性地增强FaDu异种移植物的IR效应。用M3541、IR（2Gy x 5天；总剂量：10 Gy）或IR+M3541治疗荷瘤小鼠（每臂10只），并跟踪肿瘤体积最多70天。C–F，M3541在4种异种移植模型的6周分次放疗研究中显著增强了IR疗效。用2Gy组分（开5天，关2天）照射小鼠（每只手臂10只）6周。在IR前10分钟，按指定剂量口服M3541。治疗后至少随访9周肿瘤生长情况。G–I，M3541在FaDu模型中证明了与SoC团IR+顺铂联合使用的益处。已建立异种移植物的小鼠（每臂10只）接受2 Gy IR分数（5天开/2天关），持续2周（总剂量20Gy）。在每次放射治疗前10分钟，在第0天和第7天腹膜内给予3mg/kg的顺铂和100mg/kg的M3541。G和H，肿瘤体积和体重变化。一、 无进展生存。相对肿瘤体积变化值≤73%的肿瘤被归类为事件。该截止值是根据基于肿瘤体积的进展性疾病RECIST定义选择的（44）。
图3。
M3541增强了人类肿瘤异种移植模型的IR疗效。A、，M3541抑制ATM下游磷酸化靶标p-CHK2体内.pCHK2（Thr68)根据IR（黑色）或与IR+M3541（红色）组合测量调制。FaDu异种移植荷瘤小鼠（每个治疗组和时间点5只小鼠）接受2 Gy IR的单次治疗，同时服用或不服用100 mg/kg M3541。在IR前10分钟口服M3541。在指定的时间点在肿瘤裂解物中测量pCHK2调节。测定并绘制M3541的血浆浓度（绿色）。B、，M3541剂量依赖性地增强FaDu异种移植物的IR效应。用M3541、IR（2Gy x 5天；总剂量：10 Gy）或IR+M3541治疗荷瘤小鼠（每臂10只），并跟踪肿瘤体积最多70天。C–F，M3541在使用4种异种移植模型的6周分次放疗研究中显著增强了IR疗效。用2Gy组分（开5天，关2天）照射小鼠（每只手臂10只）6周。在IR前10分钟，按指定剂量口服M3541。治疗后至少随访9周肿瘤生长情况。G–I，在FaDu模型中，M3541证明了与SoC团IR+顺铂联合使用的益处。已建立异种移植物的小鼠（每臂10只）接受2 Gy IR分数（5天开/2天关），持续2周（总剂量20Gy）。在每一次放疗前10分钟，在第0天和第7天以3 mg/kg的剂量腹腔注射顺铂，并以100 mg/kg的浓度腹腔注射M3541。G公司和H、，肿瘤体积和体重变化。我，无进展生存。相对肿瘤体积变化值≤73%的肿瘤被归类为事件。该截止值是根据基于肿瘤体积的进展性疾病RECIST定义选择的（44）。
图4。M4076是一种优良的ATM抑制剂，具有改进的药理特性。M4076结构式。B、 M4076抑制A549细胞中IR诱导的ATM信号。照射前1小时将细胞暴露于1μmol/L M4076（5Gy），6小时后制备细胞裂解物，并通过Western blotting检测ATM信号。C和D，M4076在体内抑制ATM直接磷酸化靶点p-ATM和p-CHK2。在FaDu模型中，单独使用IR或IR+M4076测量p-ATM（紫色）和p-CHK2（红色）的水平。携带已建立异种移植物的小鼠（每个治疗和剂量5只小鼠）接受2Gy IR，在IR之前30分钟口服或不口服指定剂量的M4076，并在M4076给药后2小时制备肿瘤裂解物。平行测定M4076的血浆浓度并绘制（黑色）。p-ATM和p-CHK2的基线水平由水平虚线表示。E、 M4076增强FaDu异种移植物的IR效应。FaDu荷瘤小鼠（每臂9只）按指示剂量接受IR（2Gy分数x连续5天；总IR剂量10 Gy）或IR+M4076治疗，并随访42天肿瘤生长和小鼠体重。F、 M4076增强了NCI-H1975异种移植模型的IR功效。已建立异种移植物的小鼠（每臂9只）按（E）中的方法治疗2周（总IR剂量20 Gy）。随访肿瘤生长和体重46天。G、 M4076在6周FaDu异种移植模型中显著增强IR疗效。用IR或IR+M4076治疗小鼠（每臂10只），如（E）所示，但连续6周（总IR剂量60 Gy）模拟治疗方案。随访肿瘤生长和体重143天。
图4。
M4076是一种优良的ATM抑制剂，具有改进的药理特性。A类M4076结构式。B、，M4076抑制A549细胞中IR诱导的ATM信号。照射前1小时将细胞暴露于1μmol/L M4076（5Gy），6小时后制备细胞裂解物，并通过Western blotting检测ATM信号。C类和D、，M4076抑制ATM直接磷酸化靶点p-ATM和p-CHK2，体内在FaDu模型中，测量p-ATM（紫色）和p-CHK2（红色）的水平，以响应IR单独或IR+M4076。携带已建立异种移植物的小鼠（每种治疗和剂量5只小鼠）接受2 Gy IR，在IR之前30分钟口服或不口服指定剂量的M4076，并在M4076给药后2小时制备肿瘤裂解物。平行测定M4076的血浆浓度并绘制（黑色）。p-ATM和p-CHK2的基线水平用虚线表示。E、，M4076增强FaDu异种移植物的IR效应。FaDu荷瘤小鼠（每臂9只）按指示剂量接受IR（2Gy分数x连续5天；总IR剂量10 Gy）或IR+M4076治疗，并随访42天肿瘤生长和小鼠体重。F、，M4076增强了NCI-H1975异种移植模型中的IR功效。已建立异种移植物的小鼠（每臂9只）按(E类)持续2周（总IR剂量20 Gy）。随访肿瘤生长和体重46天。G、，M4076在6周FaDu异种移植模型中显著增强IR疗效。用IR或IR+M4076治疗小鼠（每臂10只），如（E）所示，但连续6周（总IR剂量60 Gy）模拟治疗方案。随访肿瘤生长和体重143天。
图5。M4076与拓扑异构酶和PARP抑制剂协同作用。A、 在34个癌细胞系中对79种抗癌药物与M4076进行配对联合协同分析。代表不同作用模式的小分子药物与M4076在一组肿瘤细胞系中结合，并在培养五天后评估其生长/活性。计算每种药物和细胞系的幸福过剩。使用直线连接的中位数、第25百分位和第75百分位绘制了跨细胞系面板的药物联合效应图，以可视化跨细胞系板的联合效应。Bliss超过0.1和−0.1时的水平线作为弱/中等和强组合协同效应的阈值。B–C，在HCB-x9乳腺癌模型中，M4076与鲁巴昔布（B）或尼拉帕利（C）的联合作用。对口服M4076加上两种PARP抑制剂中的任何一种的HBCx-9 TNBC PDX荷瘤小鼠（B组每臂9只；C组每臂7只）的疗效和体重变化进行了45天（鲁卡帕利）或75天（尼拉帕利）的监测。D、 M4076联合伊立替康在SW620异种移植模型中的疗效和体重变化。小鼠（每臂10只）接受3×1周周期的联合治疗或各自的单药对照组。一个周期包括单次伊立替康（腹腔注射），剂量为50 mg/kg，然后24小时后10 mg/kg和25 mg/kg M4076（po），以及随后的四天。
图5。
M4076与拓扑异构酶和PARP抑制剂协同作用。A、，在34个癌细胞系中对79种抗癌药物与M4076进行配对联合协同分析。代表不同作用模式的小分子药物与M4076在一组肿瘤细胞系中结合，并在培养五天后评估其生长/活性。计算每种药物和细胞系的幸福过剩。使用线连接的中间百分位、第25百分位和第75百分位绘制整个细胞系面板的药物组合效应，以可视化整个细胞系面板的组合效应。Bliss超过0.1和-0.1的水平线是弱/中等和强组合协同效应的阈值。B–C，M4076与鲁巴匹的联合作用(B类)或尼拉帕里布(C类)在HCB-x9乳腺癌模型中。HBCx-9 TNBC PDX荷瘤小鼠的疗效和体重变化B类; 每只手臂7只老鼠C类)口服M4076加上两种PARP抑制剂中的任何一种，监测45天（rucaparib）或75天（niraparib）。D、，M4076联合伊立替康在SW620异种移植模型中的疗效和体重变化。小鼠（每臂10只）接受3×1周周期的联合治疗或各自的单药对照组。一个周期包括单次伊立替康（腹腔注射），剂量为50 mg/kg，然后24小时后10 mg/kg和25 mg/kg M4076（po），以及随后的四天。
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  • 摩尔癌症治疗。21:857.
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