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.2022年3月28日；13(6):1972-1984.
doi:10.7150/jca.66830。 eCollection 2022年。

METTL3通过COL12A1/MAPK信号通路促进食管鳞癌的进展

李佳丽 1, 李振华 2, 徐燕照 2, 朝皇 2, 宝恩山 1
附属公司

METTL3通过COL12A1/MAPK信号通路促进食管鳞癌的进展

李佳丽等。 J癌症. .

摘要

背景食管鳞状细胞癌（ESCC）是世界上最常见的侵袭性肿瘤之一。m6A修饰在许多生物过程中起着重要作用。METTL3是主要的甲基转移酶，已在包括ESCC在内的许多癌症中发现。在这里，我们研究了METTL3在ESCC发展中的潜在机制。方法：采用定量实时PCR（qRT-PCR）、免疫组织化学（IHC）和western blot检测METTL3的表达。为了评估METTL3、MTS的功能，进行了集落形成、划痕愈合试验、穿孔和侵袭试验。为了找到METTL3的下游靶点，进行了mRNA测序（mRNA-seq）。进行GO和KEGG功能富集分析，以预测可能的生物过程和信号通路。qRT-PCR和western blot检测COL12A1的表达和RAF、MRK和ERK的磷酸化状态并进行以下功能获得和丧失实验，以检测COL12A1在METTL3介导的ESCC进展中的靶基因功能。结果：使用TCGA数据库，发现食管鳞癌组织中METTL3表达较高。此外，我们发现与正常组织相比，食管鳞癌患者组织中METTL3显著增加，并且与预后不良相关。评估METTL3在ESCC细胞系中的表达。METTL3的增失功能表明其促进细胞增殖、迁移和侵袭。此外，我们证实METTL3可以促进COL12A1的表达，上调RAF、MER和ERK的磷酸化，而且COL12A可以抑制siMETTL3-介导的对ESCC增殖、迁移和侵袭的抑制。结论：我们的研究表明METTL3可能具有致癌作用，通过COL12A1/MAPK信号通路促进ESCC的进展和转移。

关键词：COL12A1；MAPK；METTL3；食管鳞癌；入侵；增殖。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
METTL3在食管鳞癌患者组织中上调，与预后不良相关。（A） 从TCGA数据下载的ESCC组织中评估了参与m6a修饰的催化蛋白，蓝色方框表示正常组织，n=11；肿瘤组织的红色方框，n=184）**P<0.01。（B） 根据GAPDH标准化的qRT-PCR（n=60）证实了参与m6a修饰的催化蛋白在ESCC原发肿瘤样本和邻近正常组织中的相对mRNA表达。METTL3、WTAP和YTHDF1在食管鳞癌组织中的表达显著高于邻近正常组织*P<0.05，**P<0.01。（C） 放大200倍后，两个患者组织中METTL3抗体免疫组化染色的代表性图像。比例尺显示100μm。（D） western blot检测METTL3蛋白在8对食管鳞癌组织（T）和邻近正常组织（N）中的表达。METTL3的相对蛋白水平相对于β-肌动蛋白进行标准化。（E） qRT-PCR检测食管鳞癌细胞系METTL3 mRNA表达水平。数据表示为平均值±标准偏差。（F） 基于METTL3 mRNA表达的60例食管鳞癌患者OS的Kaplan-Meier生存曲线。根据METTL3的中位数水平将所有患者分为两组。采用log-rank检验比较差异*P＜0.05。
图2
图2
METTL3沉默可抑制ESCC细胞系的增殖、迁移和侵袭。（A） 通过qRT-PCR和western blot检测转染siMETTL3或siControl的KYSE150和KYSE170细胞株中METTL4的表达水平。（B） 通过MTS试验和集落形成试验评估转染siMETTL3或siControl的KYSE150和KYSE170细胞的增殖能力和集落生成能力。（C-D）通过伤口愈合实验、跨阱迁移和基质凝胶侵袭实验评估转染siMETTL3或siControl的KYSE150和KYSE170细胞的细胞迁移和侵袭能力。所有数据均表示为平均值±标准偏差（n=3）*P<0.05，**P<0.01。
图3
图3
METTL3的过度表达促进了ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭。（A） 通过qRT-PCR和western blot检测转染oeMETTL3或oeVec质粒的TE1和KYSE30细胞中METTL 3的表达水平。（B） 通过MTS试验和集落形成试验评价转染oeMETTL3或oeVec质粒的TE1和KYSE30细胞的增殖能力和集落生成能力。（C-D）通过伤口愈合实验、跨阱迁移实验和基质凝胶侵袭实验评估转染oeMETTL3或oeVec质粒的TE1和KYSE30细胞的细胞迁移和侵袭能力。所有数据均表示为平均值±标准偏差（n=3）*P<0.05，**P<0.01。
图4
图4
mRNA-seq分析用于验证差异表达基因和信号通路。（A） 使用mRNA-Seq分析鉴定ESCC中METTL3调节的基因。（B-C）GO分析和KEGG通路分析预测了靶mRNA介导的可能生物过程和信号通路。（D） MAPK信号通路中23个mRNA的GO生物过程富集分析。（E） METTL3沉默KYSE150细胞中前30个差异表达基因的热图。（F） qRT-PCR分析了30个差异表达基因中的11个。（G） 通过qRT-PCR评估METTL3敲除或过度表达的ESCC细胞系中MAP2K1的相对水平。数据表示为平均值±标准偏差。**P<0.01。（H-I）western blot检测转染siMETTL3或oeMETTL3质粒的ESCC细胞中COL12A的表达和RAF/MEK/ERK通路的磷酸化状态。
图5
图5
COL12A1挽救了siMETTL3-1对ESCC增殖、迁移和侵袭的影响。与siControl+oeVec组相比，（A-B）siControl+oeCOL12A1组增加了ESCC的增殖和克隆形成，而与siMETTL3-1+oeVec组相比，siMETTL1+oeCOB12A1组也增加了ESCC+克隆形成。与siControl+oeVec组相比，（C-D）siControl+oeCOL12A1组促进了ESCC的迁移和侵袭，而siMETTL3-1+oeCOB12A1组则加速了ESCC迁移和侵袭*P<0.05，**P<0.01。
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