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.2022年4月；60(4):37.
doi:10.3892/ijo.2022.5327。 Epub 2022年2月22日。

HepaCAM‑PIK3CA轴调节谷氨酰胺代谢的重编程以抑制前列腺癌细胞增殖

何振亭 # 1, 高莹莹 # 2, 李婷 1, 余朝文 三, 欧丽萍 1, 罗春丽 1
附属公司

HepaCAM‑PIK3CA轴调节谷氨酰胺代谢的重编程以抑制前列腺癌细胞增殖

何振亭等。 国际癌症杂志. 2022年4月.

摘要

能量代谢重编程正在成为癌症越来越重要的标志。具体来说，癌症倾向于进行代谢重编程，以上调细胞依赖性谷氨酰胺（Gln）的代谢。值得注意的是，肝细胞粘附分子（HepaCAM）以前曾被报道作为肿瘤抑制剂发挥关键作用。然而，HepaCAM在前列腺癌（PCa）Gln代谢中可能的调节作用尚不清楚。在本研究中，生物信息学分析预测了临床和基因组数据集中的HepaCAM、磷脂酰肌醇‑4,5‑二磷酸3‑激酶催化亚基α（PIK3CA）、谷氨酰胺酶（GLS）和溶质载体家族1成员5（SLC1A5）的表达与谷氨酰胺代谢组分之间的显著负相关。免疫组织化学结果证实，肝癌组织中HepaCAM和PIK3CA的表达呈负相关。随后，进行了液相色谱-串联质谱（LC‑MS/MS）和气相色谱-质谱（GC‑MS）分析，结果显示PCa患者血液样本和PCa细胞中的Gln和代谢通量水平显著降低。从机制上讲，HepaCAM的过度表达通过调节PCa细胞中的PIK3CA来抑制Gln代谢和增殖。此外，由于GLS和SLC1A5的表达水平在Gln饥饿后的一段时间内保持较高水平，因此发现PCa细胞中的Gln代谢具有抗应激性。然而，HepaCAM的过度表达在一定程度上逆转了这种耐药性。此外，通过质谱和CCK‑8实验，PIK3CA的特异性抑制剂alpelisib有效增强了HepaCAM过度表达对Gln代谢和细胞增殖的抑制作用。此外，免疫组织化学也证实了PIK3CA对裸鼠肿瘤组织生长的抑制作用体内综上所述，本研究结果显示，PCa患者的血液样本中存在异常的Gln代谢谱，这表明它可以作为PCa的临床诊断工具。此外，还确定了HepaCAM/PIK3CA轴在调节Gln代谢、细胞增殖和肿瘤生长中的关键作用。高效性治疗与上调HepaCAM表达相结合可能成为治疗PCa患者的一种新方法。

关键词：5-二磷酸3-激酶催化亚基α；谷氨酰胺代谢重编程；肝细胞粘附分子；磷脂酰肌醇‑4；增殖；前列腺癌。

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数字

图1
图1
生物数据库中HepaCAM、PIK3CA和谷氨酰胺代谢相关分子之间的相关性和差异。（A和B）来自cBioportal的不同PCa数据集中HepaCAM和PIK3CA基因的变异类型和比例。利用GEO数据库（GSE21032）的（C-E）RNA-seq mRNA表达数据，比较PCa肿瘤中HepaCAM与PIK3CA、GLS和SLC1A5的相关性。（F和G）根据TCGA中HepaCAM和PIK3CA mRNA水平，PCa患者的总体生存曲线。肝细胞粘附分子；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α；GLS、谷氨酰胺酶；SLC1A5，溶质载体家族1成员5。注意：19个PCa数据集的链接在生物信息学分析第节。
图2
图2
血液样本或细胞中谷氨酰胺（Gln）/谷氨酸（Glu）水平以及组织样本中HepaCAM和PIK3CA表达的显著差异。（A） 通过质谱法测试不同血液样本中的多种常见氨基酸浓度，并通过Mann-Whitney试验进行分析。*P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001；ns，PCa与正常（正常）标本相比无显著性差异。（B） PCa和正常样品之间Glu/Gln比率的比较。***与正常标本相比，P<0.001。（C和D）前列腺癌细胞株PC3和LNCaP与正常上皮细胞RWPE-1之间Glu和Gln浓度的差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。PCa和BPH样品中HepaCAM和PIK3CA的（E-H）代表性苏木精和伊红（H&E）染色和IHC染色，放大倍数，×200。（I和J）前列腺增生和前列腺癌组织中HepaCAM和PIK3CA表达的染色分数。（K） Spearman相关分析法分析组织中HepaCAM与PIK3CA的相关性。谷氨酸；谷氨酰胺；LGPCa，低级PCa；MGPCa，中级PCa；HGPCa，高档PCa；良性前列腺增生；前列腺癌；肝细胞粘附分子；PIK3CA，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位α。
图3
图3
HepaCAM的过表达抑制前列腺癌中PIK3CA和谷氨酰胺代谢或增殖相关分子的表达。（A和B）通过（A）RT-qPCR和（B）western blot分析检测HepaCAM和PIK3CA在RWPE-1、PC3和LNCaP细胞中的表达。*P<0.05，**P<0.01，以及***与RWPE-1细胞相比，P<0.001。（C-E）在PC3和LNCaP细胞中证实了HepaCAM腺病毒的过度表达以及PIK3CA在（C）mRNA和（D和E）蛋白水平上的相应变化。用qPCR和western blot检测腺病毒Ad-HepaCAM感染后细胞内GLS、SLC1A5、cyclin D1和PCNA（F-H）mRNA和蛋白水平。β-actin作为内部对照。数据表示为3个单独实验的平均值±SD。**P<0.01和***与空白对照组相比，P<0.001。肝细胞粘附分子HepaCAM；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α；GLS、谷氨酰胺酶；SLC1A5，溶质载体家族1成员5；增殖细胞核抗原。
图4
图4
HepaCAM过度表达抑制PCa细胞中谷氨酰胺代谢重编程和增殖。（A） 集落形成测定和（B）Ad-HepaCAM处理后细胞中集落数量的统计分析。（C） CCK-8法检测Ad-HepaCAM处理后细胞的增殖活性。（D-F）质谱法检测了经Ad-HepaCAM或/和碱性处理后PCa细胞中（D）Gln和（E）Glu的浓度，以及（F）Glu/Gln比率的比较。数据表示为三个单独实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，以及***与对照组相比，P<0.001。肝细胞粘附分子；前列腺癌；谷氨酰胺；谷氨酸、谷氨酸。
图5
图5
HepaCAM的过度表达逆转了PCa细胞对谷氨酰胺代谢重编程的应激抵抗。（A） 采用RT-qPCR方法检测去谷氨酰胺后不同时间点PIK3CA、GLS和SLC1A5的mRNA表达水平。**P<0.01，以及***P<0.001 vs.0 h。（B）RT-qPCR检测Ad-HepaCAM或Gln剥夺（24 h）后PC3和LNCaP细胞中HepaCAM、PIK3CA、GLS、SLC1A5、Cyclin D1和PCNA的mRNA水平。（C和D）蛋白质印迹分析和（B）中所述分子的蛋白质表达定量。β-actin作为内部对照。数据表示为三个单独实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001；ns，不显著。肝细胞粘附分子HepaCAM；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α；GLS、谷氨酰胺酶；SLC1A5，溶质载体家族1成员5；增殖细胞核抗原。
图6
图6
HepaCAM通过调节PIK3CA抑制谷氨酰胺代谢相关和增殖相关分子的表达。（A） CCK-8试验用于检测不同浓度的碱性蛋白酶（0、4、8、12和16）的毒性µM） 在PC3细胞上。（B） Western blot分析用于评估A中使用的碱性蛋白酶浓度对PIK3CA表达的抑制作用。（C和D）Western blot分析用于检测和分析PC3和LNCaP细胞（8µM、 24小时）。（E和F）Western blot分析检测Gln剥夺24小时后HepaCAM、cyclin D1、PCNA和C中提到的分子的蛋白表达，然后用Ad-HepaCAM或/和alpelisib处理72小时。β-actin作为内部对照。数据表示为三个单独实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，以及***与对照组相比，P<0.001。肝细胞粘附分子；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α；GLS、谷氨酰胺酶；SLC1A5，溶质载体家族1成员5；增殖细胞核抗原；谷氨酰胺。
图7
图7
（A-C）Alpelisib显著抑制异种移植瘤生长体内（D）IHC染色检测高可能性组和匹配组肿瘤组织中PIK3CA和Ki67的表达。放大倍数，×100。PIK3CA，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位α。***与对照组相比，P<0.001。
图8
图8
HepaCAM通过调节PIK3CA调节PCa的谷氨酰胺代谢重编程和细胞增殖。（A） 集成电路50在Ad-GFP或Ad-HepaCAM组（450 nm，72 h）中，通过CCK-8测定PC3和LNCaP细胞的可能性值。（B） 经Ad-HepaCAM或/和alpeilisib处理后，IF检测PC3和LNCaP细胞中Ki-67核表达和（C）阳性指数。*P<0.05，**P<0.01，以及***P<0.001。（D） 流式细胞术检测细胞经Ad-HepaCAM或/和alpelisib培养后的细胞周期分布，并进行（E）统计分析。数据表示为三个单独实验的平均值±SD。肝细胞粘附分子HepaCAM；前列腺癌；集成电路50，最大抑制浓度的一半。
图9
图9
HepaCAM抑制PCa谷氨酰胺代谢的机制。HepaCAM通过PIK3CA信号抑制谷氨酰胺代谢相关分子GLS1、SLC1A5的表达，减少谷氨酰胺的运输和分解，从而抑制由三羧酸循环（TCA）驱动的增殖。肝细胞粘附分子；前列腺癌；磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α；GLS、谷氨酰胺酶；SLC1A5，溶质载体家族1成员5。
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本研究得到了国家自然科学基金（批准号81272572）的资助。