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.2022年2月19日；8(1):73.
doi:10.1038/s41420-021-00793-6。

LncRNA SND1-IT1通过miR-124/COL4A1轴促进TGF-β1诱导的胃癌上皮间质转化

杨志虎 # 1, 胡志立 # 2, 廖天佑 # 三, 袁丽（音） 4, 云龙盘 5
附属公司

LncRNA SND1-IT1通过miR-124/COL4A1轴促进TGF-β1诱导的胃癌上皮间质转化

杨志虎等。 细胞死亡发现. .

摘要

肿瘤细胞从上皮向间充质样表型的转化，被称为上皮-间充质转化（EMT），是包括胃癌（GC）在内的人类癌症转移的关键标志。然而，已经研究了大量非编码RNA的功能，它们通过调节癌基因或肿瘤抑制因子来启动或抑制GC细胞中的这种表型转换。本文旨在GC环境下鉴定lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1基因，重点研究它们对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的EMT的影响。这项研究包括52对病变组织和邻近无病变组织的样本，这些组织是从确诊为GC的患者手术切除的。用外源性TGF-β1（2 ng/mL）刺激HGC-27细胞。通过RT-qPCR测定lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达。采用CCK-8分析、Transwell分析、EMT特异性标记物的免疫印迹分析和肿瘤侵袭标记物来评估培养的HGC-27细胞的细胞活力、迁移和侵袭。荧光素酶活性测定分别检测miR-124与lncRNA SND1-IT1和COL4A1的结合。LncRNA SND1-IT1在GC组织和细胞中上调。TGF-β1刺激EMT并调节HGC-27细胞中lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达。LncRNA SND1-IT1敲低调节了HGC-27细胞的活力、迁移和侵袭。LncRNA SND1-IT1通过海绵miR-124参与GC中TGF-β1刺激的EMT。MiR-124通过靶向COL4A1减弱GC中TGF-β1刺激的EMT。这些结果初步证明TGF-β1可以通过GC中的SND1-IT1/miR-124/COL4A1轴调节癌细胞的迁移、侵袭和刺激EMT。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。LncRNA SND1-IT1在GC组织和细胞中上调。
A类检测肿瘤组织中LncRNA SND1-IT1的表达水平(n个 = 52）通过RT-qPCR并与相邻的非肿瘤组织进行比较(n个 = 52).B类采用RT-qPCR方法检测四种GC细胞中lncRNA SND1-IT1的表达水平，并与GES1细胞进行比较。的结果A类和B类被归一化为GAPDH表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.
图2
图2。LncRNA SND1-IT1敲除抑制GC细胞增殖和TGF-β1诱导的EMT。
A类在HGC-27细胞中构建sh-SND1-IT1。随后对未经处理的HGC-27细胞、表达空载体的HGC-23细胞和表达lncRNA SND1-IT1的HGC-7细胞进行分析。B类采用CCK-8法检测HGC-27细胞活力。C类HGC-27细胞从上部transwell室迁移或侵入底部transwell室的代表性显微照片。D类HGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的定量分析。E类HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复**P（P） < 0.01.
图3
图3。TGF-β1刺激EMT并调节lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达。
A类CCK-8检测TGF-β1刺激后HGC-27细胞的活性。B类TGF-β1刺激后HGC-27细胞从上跨井腔迁移或侵入下跨井腔的典型显微照片。C类定量分析TGF-β1刺激后HGC-27细胞从上跨井腔迁移或侵入下跨井腔。D类TGF-β1刺激HGC-27细胞中E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。E类用RT-qPCR法测定TGF-β1刺激的HGC-27细胞中lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达水平。F类TGF-β1刺激下HGC-27细胞中COL4A1的代表性免疫印迹和定量分析。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图4
图4。LncRNA SND1-IT1参与TGF-β1刺激的GC EMT。
A类通过递送靶向LncRNA SND1-IT1的shRNA构建LncRNA SND1-IT1敲低HGC-27细胞。在TGF-β1处理的HGC-27细胞中进行后续分析，包括或不包括lncRNA SND1-IT1敲除。B类采用CCK-8检测HGC-27细胞的活性。C类HGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的典型显微照片。D类HGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的定量分析。E类HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.
图5
图5。LncRNA SND1-IT1在GC中吸附miR-124。
A类检测肿瘤组织中miR-124的表达水平(n个 = 52）通过RT-qPCR并与相邻的非肿瘤组织进行比较(n个 = 52).B类GC组织中lncRNA SND1-IT1和miR-124的Spearman相关分析。C类采用RT-qPCR方法检测四种GC细胞中miR-124的表达水平，并与GES1细胞进行比较。D类星基数据库中lncRNA SND1-IT1转录物中推测的miR-124结合位点(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php).E类在miR-124模拟物存在的情况下，测定了含有wt-lncRNA SND1-IT1和mut-lncRNA SND1-ITI的报告基因启动子的荧光素酶活性。F类在lncRNA SND1-IT1过度表达和敲除后，通过RT-qPCR测定HGC-27细胞中MiR-124的表达，并将其归一化为U6表达*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.
图6
图6。LncRNA SND1-IT1海绵miR-124参与TGF-β1刺激的GC EMT。
A类采用RT-qPCR方法检测miR-124在TGF-β1刺激的HGC-27细胞中的表达水平，并用sh-SND1-IT1和miR-124-抑制剂进行抑制。B类采用CCK-8检测sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂对TGF-β1刺激的HGC-27细胞的活性。C类经sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂处理后，TGF-β1刺激的HGC-27细胞从上跨孔室迁移或侵入下跨孔室的典型显微照片。D类用sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂处理后，TGF-β1刺激的HGC-27细胞从上transwell室迁移或侵入下transwell室的定量分析。E类经sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂处理的TGF-β1刺激的HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.
图7
图7。MiR-124靶向并抑制COL4A1。
A类测定肿瘤组织中COL4A1的表达水平(n个 = 52）通过RT-qPCR并与相邻的非肿瘤组织进行比较(n个 = 52).B类GC组织中miR-124与COL4A1的Spearman相关分析。C类通过RT-qPCR和免疫印迹法检测COL4A1在4个GC细胞和GES1细胞中的表达水平。D类星基数据库中COL4A1 mRNA 3′UTR中推测的miR-124结合位点。E类在miR-124模拟物存在下，含有COL4A1-wt或COL4A1-mut的报告基因启动子的荧光素酶活性。F类外源性添加miR-124模拟物和miR-124-抑制剂后COL4A1蛋白的代表性免疫印迹和定量分析。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.
图8
图8。MiR-124通过靶向COL4A1减弱GC中TGF-β1刺激的EMT。
A类利用miR-124模拟物和COL4A1表达载体，通过RT-qPCR检测TGF-β1刺激的HGC-27细胞中COL4Al的表达水平。B类使用miR-124模拟物和COL4A1表达载体进行CCK-8检测TGF-β1刺激的HGC-27细胞的活性。C类经miR-124模拟物和COL4A1表达载体处理后，TGF-β1刺激的HGC-27细胞从上穿孔室迁移或侵入下穿孔室的典型显微照片。D类定量分析经miR-124模拟物和COL4A1表达载体处理后TGF-β1刺激的HGC-27细胞从上跨阱腔迁移或侵入下跨阱室。E类经miR-124模拟物和COL4A1表达载体处理的TGF-β1刺激的HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.
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