LncRNA SND1-IT1通过miR-124/COL4A1轴促进TGF-β1诱导的胃癌上皮间质转化

LncRNA SND1-IT1敲除抑制GC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT

用靶向lncRNA SND1-IT1的siRNA转染HGC-27细胞，然后在不添加TGF-β1的情况下进行培养。靶向lncRNA SND1-IT1的siRNA可显著降低HGC-27细胞中lncRNA的SND1-ITI。如图所示。​图2A，2年，构建si-SND1-IT1 HGC-27细胞。结果表明，lncRNA SND1-IT1的敲除抑制了HGC-27细胞的存活、迁移和侵袭（图。2B–D型). 为了更好地了解lncRNA SND1-IT1是否在功能上影响GC细胞的迁移和侵袭特性，我们进行了免疫印迹以确定（图。​（图2E），第二版)毫不奇怪，免疫印迹结果显示，si-SND1-IT1 HGC-27细胞中内源性E-cadherin表达下降，而内源性N-cadherin的表达增加。这些结果表明，敲低lncRNA SND1-IT1导致抑制GC细胞迁移和侵袭，同时增强EMT。

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图2

LncRNA SND1-IT1敲低抑制GC细胞增殖和TGF-β1诱导的EMT。

一个在HGC-27细胞中构建sh-SND1-IT1。随后对未经处理的HGC-27细胞、表达空载体的HGC-23细胞和表达lncRNA SND1-IT1的HGC-7细胞进行分析。B类采用CCK-8法检测HGC-27细胞活力。CHGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的典型显微照片。D类HGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的定量分析。E类HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复**P（P） < 0.01.

TGF-β1刺激EMT并调节GC中lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达

TGF-β1通过刺激GC中的EMT过程促进肿瘤转移[23]. 在该部分中，HGC-27细胞在添加或不添加TGF-β1的情况下进行培养。CCK-8和transwell分析的结果显示TGF-β1刺激促进了HGC-27细胞的存活、迁移和侵袭（图。3A–C级). 正如我们预期的那样，免疫印迹显示TGF-β1刺激导致E-钙粘蛋白下降，N-钙粘蛋白升高（图。​（图3D）。三维). qRT-PCR结果显示，TGF-β1刺激导致lncRNA SND1-IT1和COL4A1表达升高，miR-124表达降低（图。​（图3E）。第三方). 正如我们预期的那样，免疫印迹显示TGF-β1刺激导致COL4A1升高（图。​（图3F）。第三层). 上述结果表明TGF-β1刺激EMT并调节lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达。

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图3

TGF-β1刺激EMT并调节lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达。

一个进行CCK-8测定以检测TGF-β1刺激后HGC-27细胞的活力。B类TGF-β1刺激后HGC-27细胞从上跨井腔迁移或侵入下跨井腔的典型显微照片。C定量分析TGF-β1刺激后HGC-27细胞从上跨井腔迁移或侵入下跨井腔。D类TGF-β1刺激HGC-27细胞中E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。E类用RT-qPCR法测定TGF-β1刺激的HGC-27细胞中lncRNA SND1-IT1、miR-124和COL4A1的表达水平。F类TGF-β1刺激HGC-27细胞中COL4A1的代表性免疫印迹和定量分析。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.

LncRNA SND1-IT1参与TGF-β1刺激的GC EMT

用靶向lncRNA SND1-IT1的siRNA转染HGC-27细胞，然后加入TGF-β1进行培养。靶向lncRNA SND1-IT1的siRNA显著地击倒HGC-27细胞中的lncRNA。​（图4A）。4A级). LncRNA SND1-IT1敲除被发现可以抵消TGF-β1刺激的作用，并调节HGC-27细胞的活性、迁移和侵袭（图。4B–D级). 正如我们所预期的，免疫印迹还表明lncRNA SND1-IT1敲低逆转了TGF-β1刺激的作用，减少了N-钙粘蛋白，并增加了E-钙粘蛋白（图。​（图4E）。第四版). 此外，我们发现TGF-β1的刺激抵消了lncRNA NEAT1敲除对这些蛋白质的影响。这些数据支持TGF-β1通过上调GC中lncRNA SND1-IT1的表达来刺激EMT的观点。

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图4

LncRNA SND1-IT1参与TGF-β1刺激的GC EMT。

一个通过传递靶向LncRNA SND1-IT1的shRNA构建LncRNA SND1-IT1敲除HGC-27细胞。在TGF-β1处理的HGC-27细胞中进行后续分析，包括或不包括lncRNA SND1-IT1敲除。B类采用CCK-8检测HGC-27细胞的活性。CHGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的典型显微照片。D类HGC-27细胞从上跨井室迁移或侵入下跨井室的定量分析。E类HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± 三次技术重复的SD*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.

GC中LncRNA SND1-IT1海绵miR-124

LncRNAs可以作为竞争性内源性RNAs（ceRNAs），通过竞争人类共享的miRNAs来调节基因表达。鉴于此，我们很好奇miR-124是否参与了GC中EMT中lncRNA SND1-IT1的调节。我们首先通过RT-qPCR对52对GC患者手术切除的病变组织和无病变组织的miR-124表达进行了定量。结果表明，miR-124在病变组织中的表达低于相邻无病变组织（图。​（图5A），5A级)与lncRNA SND1-IT1表达呈负相关（图。​（图5B）。5亿). 同样，我们检测了四个选定GC细胞和GES1中miR-124的表达，发现miR-124在四个选定的GC细胞中的表达水平低于GES1细胞（图。​（图5C）。5摄氏度). lncRNA-miRNA预测显示lncRNA-SND1-IT1转录物中存在假定的miR-124结合位点（图。​（图5D）。第五天). 双荧光素酶报告基因分析进一步证明了LncRNA SND1-IT1与miR-124结合，在miR-124-模拟物存在的情况下，与含有mut-LncRNA SND1-IT1的报告基因相比，含有wt-LncRNA SND1-ITI报告基因启动子处的荧光素酶亮度降低（图。​（图5E）。第五版). qRT-PCR结果表明，lncRNA SND1-IT1的过度表达降低了miR-124，而lncRNA的SND1-ITI的敲除增加了miR-127（图。​（图5F）。5楼). 这些结果表明lncRNA SND1-IT1在GC中海绵状miR-124。

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图5

GC中LncRNA SND1-IT1海绵miR-124。

一个检测肿瘤组织中miR-124的表达水平(n个 = 52）通过RT-qPCR并与相邻的非肿瘤组织进行比较(n个 = 52).B类GC组织中lncRNA SND1-IT1和miR-124的Spearman相关分析。C采用RT-qPCR方法检测四种GC细胞中miR-124的表达水平，并与GES1细胞进行比较。D类星基数据库中lncRNA SND1-IT1转录物中推测的miR-124结合位点(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php).E类在miR-124模拟物存在的情况下，测定了含有wt-lncRNA SND1-IT1和mut-lncRNA SND1-ITI的报告基因启动子的荧光素酶活性。F类在lncRNA SND1-IT1过表达和敲低后，通过RT-qPCR在HGC-27细胞中测定MiR-124的表达，标准化为U6表达*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.

LncRNA SND1-IT1海绵miR-124参与TGF-β1刺激的GC EMT

接下来我们进行了一项机制研究，即lncRNA SND1-IT1与miR-124的相互作用控制GC中TGF-β1刺激的EMT。我们将靶向lncRNA SND1-IT1和miR-124抑制剂的shRNA在外源性TGF-β1的存在下单独或联合导入HGC-27细胞。如图所示。​图6A，6A级外源性TGF-β1抑制miR-124的表达，而lncRNA SND1-IT1敲除后进一步上调HGC-27细胞中miR-124。CCK-8和Transwell分析显示预期结果，miR-124抑制剂促进HGC-27细胞的存活、迁移和侵袭，模拟TGF-β1刺激的作用，但逆转lncRNA SND1-IT1敲除的作用（图。6B–D型). 免疫印迹还显示，TGF-β1刺激的HGC-27细胞中E-钙粘蛋白显著增加，同时N-钙粘蛋白下降，lncRNA SND1-IT1被敲除，而miR-124被抑制后，结果被逆转（图。​（图6E）。第六版). 这些数据支持lncRNA SND1-IT1海绵miR-124参与GC中TGF-β1刺激的EMT的概念。

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图6

LncRNA SND1-IT1海绵miR-124参与TGF-β1刺激的GC EMT。

一个使用sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂，通过RT-qPCR测定TGF-β1刺激的HGC-27细胞中miR-124的表达水平。B类采用CCK-8检测sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂对TGF-β1刺激的HGC-27细胞的活性。C经sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂处理后，TGF-β1刺激的HGC-27细胞从上跨孔室迁移或侵入下跨孔室的典型显微照片。D类定量分析经sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂处理后TGF-β1刺激的HGC-27细胞从上跨阱室迁移或侵入下跨阱室内。E类经sh-SND1-IT1和miR-124抑制剂处理的TGF-β1刺激的HGC-27细胞中E-cadherin和N-cadherin的代表性免疫印迹和定量分析。结果被归一化为β-肌动蛋白表达。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.

MiR-124靶向并抑制GC中的COL4A1

据我们所知，特定mRNA的miRNA调节网络在人类疾病中起着至关重要的作用。我们认为调节基因表达的miR-124在GC中承担lncRNA SND1-IT1的调节。起初，我们用RT-qPCR检测了52对病变组织和无病变组织中COL4A1的表达。结果表明，COL4A1在病变组织中的表达高于无病变组织（图。​（图7A），第7章)与miR-124表达呈负相关（图。​（图7B）。第7页). 发现COL4A1在四个选定的GC细胞中的表达水平高于GES1细胞（图。​（图7C）。7摄氏度). 我们对星基COL4A1 mRNA 3′UTR中miR-124结合位点进行了网络可用预测（图。​（图7D）。第7天). 我们还观察到，在miR-124模拟物存在的情况下，含有COL4A1-wt而非COL4A1-mut的报告基因启动子的荧光素酶活性显著降低（图。​（图7E）。第七版). 除了双荧光素酶报告基因分析外，免疫印迹法还证明miR-124对COL4A1具有靶向抑制作用，如HGC-27细胞中对miR-124-模拟物的反应中COL4Al下降，对miR-24-抑制剂的反应中增加COL4A1-（图。​（图7F）。第7页). 这些数据表明miR-124靶向并抑制GC中的COL4A1。

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图7

MiR-124靶向并抑制COL4A1。

一个检测COL4A1在肿瘤组织中的表达水平(n个 = 52）通过RT-qPCR并与相邻的非肿瘤组织进行比较(n个 = 52).B类GC组织中miR-124与COL4A1的Spearman相关分析。C通过RT-qPCR和免疫印迹法检测COL4A1在4个GC细胞和GES1细胞中的表达水平。D类星基数据库中COL4A1 mRNA 3′UTR中推测的miR-124结合位点。E类在miR-124模拟物存在下，含有COL4A1-wt或COL4A1-mut的报告基因启动子的荧光素酶活性。F类外源性添加miR-124模拟物和miR-124-抑制剂后COL4A1蛋白的代表性免疫印迹和定量分析。值表示为平均值 ± SD来自三次技术重复**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001.

细胞培养

我们从ATCC（美国）购买了四种类型的人类GC细胞系AGS、HGC-27、NCI-N87、MKN74和一种人类正常胃上皮细胞GES1，所有这些细胞都是在RPMI1640（美国纽约州大岛吉布科）中采集的，其中含有10%的胎牛血清（中国杭州四季春FBS），100 U/L青霉素/100 mg/L链霉素（Gibco）。细胞采集在培养箱中进行（37 °C，5%一氧化碳₂).

瞬时转染

两个pcDNA3.1构建物包含人类SND1-IT1全长互补DNA（cDNA）和COL4A1 cDNA，一种抗SND1-ITI siRNA构建物，miR-124模拟物，和miR-124抑制剂，并按照制造商提供的说明使用脂质体2000试剂单独或联合导入HGC-27细胞（Invitrogen，美国）。瞬时转染后48小时，用外源性TGF-β1（2）刺激HGC-27细胞 纳克/毫升，西格玛化学公司，奥尔德里奇有限公司） h.所有结构物、miR-124模拟物、miR-124抑制剂及其相应的NC均由GenePharma（中国上海）合成。

RNA提取、反转录和实时qPCR（RT-qPCR）

使用TRIzol试剂（Takara，大连，中国）提取总RNA。按照制造商提供的说明，使用PrimeScript RT试剂盒（RR047A，中国大连塔卡拉）合成cDNA。RT-qPCR使用SYBR®Premix ExTaqTM II（Perfect Real Time）试剂盒（DRR081，Takara，Japan）进行，并使用PCR仪器（ABI，Foster City，CA，USA）进行分析，每个反应一式三份。底漆（表​（表2）2)由Sangon（中国上海）生成。MiR-124表达水平归一化为U6，SND1-IT1表达水平标准化为GAPDH。使用2计算表达的折叠变化^−ΔΔCtΔCt表示每个靶点的阈值周期（Ct）与内务mRNA或miRNA水平之间的差异。

免疫印迹法

在RIPA缓冲液中获得总蛋白（Beyotime Biotechnology），50 将每次运行的μg蛋白质样品加载到10%SDS-PAGE的微孔中进行分离，然后湿传递到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。膜用E-钙粘蛋白（ab15148）、N-钙粘素（ab18203）、IV型胶原（ab6586）和β-肌动蛋白（ab227387）抗体（Abcam，Cambridge，UK）免疫反应。用辣根过氧化物酶标记的IgG和增强化学发光（ECL）试剂（BB-3501，Amersham Pharmacia，UK）对免疫印迹进行可视化，并使用凝胶文档系统（Bio-Rad Quantity One Software v4.6.2，Bio-RadLaboratories，Richmond，California，USA）进行定量。靶蛋白的灰度值被归一化为β-肌动蛋白。

CCK-8分析

将HGC-27细胞接种在96个平板（5×10）中^三每个井）过夜。治疗24天后 h、 10个 将μL CCK-8试剂（中国上海贝尤蒂姆）添加到每个孔中，并进一步培养2个 37小时 摄氏度。最后，在450℃下测量HGC-27细胞的吸光度 nm，使用微孔板阅读器（ThermoFisher Scientific）。

Transwell分析

细胞迁移和侵袭分析在24孔跨孔室（8 mm孔径）中进行。简而言之，HGC-27细胞被无血清饥饿24小时 h、 然后再悬浮到3×10⁵无血清DMEM中的细胞/mL。悬架（100 μL）的HGC-27细胞被添加到涂有或不涂有（用于细胞侵袭试验）50 μL Matrigel由无血清培养基预培养。在37°C下培养24小时后，转移到下室的细胞含有500 添加10%FBS的μL DMEM经过4%多聚甲醛固定（10 最小值）和0.1%结晶紫染色（10 最小值）。在六个随机显微镜下对染色细胞进行计数。

双荧光素酶报告基因测定

COL4A1 mRNA 3′UTR上的LncRNA SND1-IT1转录物或寡核苷酸，包含假定的miR-124结合位点（命名为LncRNA SND1-IT1-wt或COL4A1-wt）和假定的miR-124结合部位突变的LncRNA SND1-IT1或COL4 A1（命名为incRNA SND-IT1-mut或COL 4A1-mut）人工合成并插入到市售荧光素酶报告载体pGL3载体中（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）。将具有miR-124模拟物的精心设计的pMIR报告载体导入HGC-27细胞（上海北诺生物科技有限公司，中国上海）。按照制造商的说明，使用双荧光素酶测定法（Promega）测定萤火虫荧光素酶的发光。

我们衷心感谢审稿人的建设性意见。