Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) inhibition promotes pulmonary metastasis of osteosarcoma by boosting ezrin phosphorylation

doi:10.7150/ijbs.58784

.2022年1月9日；18(3):1238-1253.

doi:10.7150/ijbs.58784。 eCollection 2022年。

抑制聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）通过增强ezrin磷酸化促进骨肉瘤肺转移

李方飞^1 2 三, 吴晓秋^1 2 三, 傅学坤^1 4, 刘锦^1 2 三, 王泽松⁵, 加里·桂珊·肖⁵, 爱平路^{1 2 三 6 7}, Ge Zhang先生^1 2 三

附属机构

¹香港浸会大学中医学院肿瘤与炎症研究纪念中心（CCIR），中国香港特别行政区，999077。
²香港浸会大学罗绍辉骨关节疾病转化医学研究所，中国香港特别行政区，999077。
^三广东-香港-澳门中医药与免疫疾病研究联合实验室，999077，中国香港特别行政区。
⁴南方科技大学生物系，深圳518055，中国。
⁵大连理工大学化学工程学院药理学系，辽宁大连116024。
⁶中国中医科学院临床医学基础研究所，100700，北京，中国。
⁷上海中医科学院关节炎研究所，200032，中国上海。

PMID： 35173550
预防性维修识别码： PMC8771856号
内政部： 10.7150/ijbs.58784

抑制聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）通过增强ezrin磷酸化促进骨肉瘤肺转移

李方飞等。国际生物科学杂志. 2022.

.2022年1月9日；18(3):1238-1253.

doi:10.7150/ijbs.58784。 eCollection 2022年。

作者

李方飞^1 2 三, 吴晓秋^1 2 三, 傅学坤^1 4, 金柳（Jin Liu）^1 2 三, 王泽松⁵, 加里·桂珊·肖⁵, 爱平路^{1 2 三 6 7}, Ge Zhang先生^1 2 三

附属机构

¹香港浸会大学中医学院肿瘤与炎症研究纪念中心（CCIR），中国香港特别行政区，999077。
²香港浸会大学罗绍辉骨关节疾病转化医学研究所，中国香港特别行政区，999077。
^三广东-香港-澳门中医药与免疫疾病研究联合实验室，999077，中国香港特别行政区。
⁴南方科技大学生物系，深圳518055，中国。
⁵大连理工大学化学工程学院药理学系，辽宁大连116024。
⁶中国中医科学院临床医学基础研究所，100700，北京，中国。
⁷上海中医科学院关节炎研究所，200032，中国上海。

PMID： 35173550
预防性维修识别码： PMC8771856号
内政部： 10.7150/ijbs.58784

摘要

由于OS患者中BRCA缺乏和染色体不稳定的比例很大，聚ADP-核糖聚合酶抑制剂（PARPi）可能是一种有效的抗OS治疗策略。在两个原位OS小鼠模型中，我们发现，尽管PARPi对原位OS肿瘤的生长具有抑制作用，但无论BRCA是否缺乏，PARPi的治疗都会加重两个模型中OS的肺转移。一种在OS转移中起关键作用的蛋白ezrin被鉴定为PARP1的交互蛋白。在PARP抑制期间，ezrin的磷酸化显著增强。除了磷酸化ezrin在质膜上的传统功能外，我们新鉴定了其核斑点定位及其与mRNA输出的功能。Ezrin敲低或磷酸化抑制可以部分挽救PARPi诱导的转移。总之，我们揭示了PARP参与OS转移的新机制，提出了一种新的联合治疗策略，即使用PARP和ezrin抑制剂来治疗OS。

关键词：骨肉瘤；PARP1；联合治疗。；埃兹林；转移。

©作者。

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利益冲突声明

竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
**Olaparib在荷瘤小鼠模型中促进骨肉瘤的肺转移。（A）**荷瘤小鼠的药物调度。**（B）**143B或143B-mCherry接种NOD/SCID小鼠的OS组织体积，计算公式为：体积=（宽度）²x长度/2，减去健侧非肿瘤后肢的正常组织体积。n=每组15人。**（C）**NOD/SCID小鼠经奥拉帕林或载体治疗后的肺转移的代表性荧光图像和原位143B-mCherry肿瘤的X射线图像。**（D）**用奥拉帕林或载体治疗的NOD/SCID小鼠原位143B-m樱桃瘤的重量（平均值±s.e.m.；每组15只小鼠）。**（E）**NOD/SCID小鼠每个肺切片的转移性结节数（平均值±s.e.m.）。**（F）**来自143B mCherry接种的NOD/SCID小鼠的肺切片的代表性荧光图像，所述小鼠具有或不具有奥拉帕尼治疗。比例尺，100μm。**（G）**流式细胞术分析肺中mCherry细胞的百分比（每组15只小鼠）。**（H）**流式细胞术分析NOD/SCID小鼠血液中的CTC（每组15只小鼠）。**（一）**显示BALB/c小鼠原位K7M2肿瘤和肺组织的典型图像。**（J）**用奥拉帕林或载体治疗的BALB/c小鼠原位K7M2肿瘤的重量（n=15只/组）。**（K）**BALB/c小鼠每个肺切片的转移结节数（平均值±标准偏差）。

图2
**PARP1介导的聚（ADP-核糖）减少增强了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭特性。（A）**集落形成试验用于检测用DMSO或olaparib处理48小时后143B和K7M2细胞的增殖。**（B）**使用伤口愈合试验测试了经二甲基亚砜或奥拉帕林处理的143B和K7M2细胞的迁移特性。通过使用ImageJ软件进行分析，确定伤口闭合百分比的量化。三个独立实验的平均+/-S.D。比例尺，300μm。**（C）**在小室侵袭实验中观察到143B和K7M2细胞的胶原蛋白-IV凝胶与DMSO或olaparib的侵袭行为。比例尺，100μm。**（D）**通过伤口愈合试验检测PARP1和PARP2基因敲除对143B细胞迁移特性的影响。比例尺，300μm。**（E）**通过小室侵袭实验检测PARP1和PARP2基因敲除对143B细胞侵袭行为的影响。比例尺，100μm。**（F）**用于检测分别用DMSO和PARP抑制剂处理的OS细胞迁移特性的创伤愈合试验。**（G）**DMSO和PARP抑制剂处理的OS细胞的跨孔侵袭分析。**（H）**用DMSO或奥拉帕尼处理的143B和K7M2细胞在纤连蛋白或胶原I型包被板上的粘附能力的代表性图像。通过560 nm处的OD值确定粘附细胞的定量。

图3
**PARPi治疗诱导骨肉瘤细胞EMT。（A）**显示二甲基亚砜和奥拉帕林处理细胞EMT形态变化的相控图像。比例尺，100μm。**（B）**通过western blotting分析确定奥拉帕林治疗对EMT标记物蛋白水平的影响。**（C）**提取经二甲基亚砜或olaparib处理的OS细胞中的总RNA，并通过RT-qPCR检测olapari处理对EMT标记mRNA水平的影响。**（D）**如图所示，DMSO或olaparib处理的143B细胞在有或无olaparin维持的不同时间段内受到转录抑制。RT-qPCR用于评估EMT标记的剩余mRNA水平。插图中显示了不同样品的半衰期。**（E）**提取经DMSO或olaparib处理的143B细胞的胞浆RNA，并通过RT-qPCR检测olaparip处理对EMT标记物mRNA水平的影响。

图4
**Olaparib诱导的OS迁移和侵袭依赖于ezrin。（A）**在OS细胞裂解液中进行基于人重组his-tagged PARP1蛋白的下拉分析，以鉴定PAPR1相互作用蛋白。以人血清白蛋白（HSA）为对照。获得的蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶中通过银染分离。**（B）**在OS细胞裂解物中使用抗PARP1抗体诱饵PARP1相互作用蛋白的co-IP分析。IgG作为阴性对照。获得的蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶中通过银染分离。**（C）**将143B细胞裂解物与抗PARP1或对照IgG抗体进行co-IP，然后用所示抗体进行免疫印迹，以验证ezrin和PARP1之间的相互作用（n=3）。**（D）**伤口愈合试验的代表性图像显示了奥拉帕林对埃兹林野生型（ezrin）细胞迁移的影响^重量)和埃兹林击倒（埃兹林^杜兰特)143B细胞。使用ImageJ分析伤口间隙。比例尺，300μm。**（E）**transwell分析的代表性图像显示了奥拉帕林对埃兹林野生型（ezrin）细胞侵袭的影响^重量)和埃兹林击倒（埃兹林^杜兰特)143B细胞。在滤光片下表面的15个随机区域中计数侵入细胞，并用侵入细胞与载体组的比率（倍）表示。比例尺，300μm。**（F）**携带原位ezrin的NOD/SCID小鼠的体重^重量或埃兹林^杜兰特用奥拉帕尼或载体治疗的143B mCherry肿瘤（平均值±s.e.m.；每组n=8只小鼠）。使用单向方差分析和Tukey多重比较检验进行统计分析。**（G）**用奥拉帕林或载体治疗的NOD/SCID小鼠的每肺转移结节数。

图5
**PARP1触发的ezrin的PAR化阻碍了其磷酸化。（A）**siRNA诱导的PARP1敲除和奥拉帕布抑制PARP酶均增加了ezrin磷酸化，而不影响总ezrin.用western blotting测定PAR、p-ezrin、ezrin和PARP1的蛋白水平。β-actin作为负荷对照。**（B）**Olaparib促进p-Ezrin的磷酸化，该磷酸化独立于激酶。**（C）**使用截短版本的ezrin，通过co-IP鉴定ezrin-与PARP1的结合域，并通过western blotting进行验证。**（D）**埃兹林与PARP1相互作用的分子模型。**（E）**伤口愈合试验的代表性图像显示奥拉帕林对ezrin细胞迁移的影响^KD+WT和埃兹林^KD+Mut143B细胞。使用ImageJ分析伤口间隙。比例尺，300μm。**（F）**跨阱分析的代表性图像显示了奥拉帕林对埃兹林细胞侵袭的影响^KD+WT和埃兹林^KD+Mut143B细胞。在滤光片下表面的15个随机区域中计数侵入细胞，并用侵入细胞与载体组的比率（倍）表示。

图6
**磷酸化埃兹林定位于细胞核斑点并促进RNA输出。（A）**p-Ezrin和Ezrin在143B细胞中的亚细胞定位及其与核斑点标记SC-35的共定位。**（B）**Western blot分析在OS细胞不同细胞成分中p-Ezrin和Ezrin的定位。检测拉明B作为负荷控制。**（C）**使用或不使用奥拉帕林治疗的OS细胞细胞核中p-Ezrin水平的共焦成像。**（D）**western blotting法测定经或不经olaparib处理的OS细胞分离的核蛋白中p-Ezrin的水平。**（E）**根据ImageJ软件的western blotting分析，计算了奥拉帕林处理细胞与载体中ezrin、p-ezrin的相对蛋白水平。免疫印迹法至少重复了三次。**（F）**埃兹林RNA输出的典型免疫荧光图像^KD+WT或ezrin^KD+Mut用二甲基亚砜、奥拉帕尼处理的细胞。比例尺=50μm。**（G）**纤维连接蛋白在胞浆或整个ezrin中的mRNA^KO+WT或埃兹林^KO+静音用DMSO或olaparib处理的细胞。**（H）**胞浆或整个ezrin中波形蛋白的mRNA^KD+WT或埃兹林^KD+Mut用DMSO或olaparib处理的细胞。**（一）**蛋白质印迹法分析埃兹林中纤维连接蛋白和波形蛋白的蛋白水平^KD+WT或埃兹林^KD+静音用DMSO或olaparib处理细胞。β-actin作为负荷对照。

图7
**olaparib与ezrin抑制剂NSC668394（EZRi）联合使用可挽救olapari诱导的OS肺转移。（A）**143B-mCherry接种的NOD/SCID小鼠经载体、Olaparib、EZRi或Olaparlib和EZRi联合治疗后，OS肿瘤、肺转移的典型生物声像图和肺切片微转移的mCherry-荧光的典型图像。**（B）**143B-mCherry接种NOD/SCID小鼠的原位143B-m樱桃肿瘤重量，这些小鼠接受了载体、奥拉帕林、EZRi或奥拉帕布和EZRi-的联合治疗（n=15只/组）。**（C）**每次治疗后，接种NOD/SCID小鼠的143B-mCherry肺中可见的转移性143B-m樱桃结节数量（平均值±标准偏差）。**（D）**143B-mCh的百分比⁺用流式细胞术分析143B-mCherry接种NOD/SCID小鼠的肺组织，每组15只小鼠。**（E）**通过流式细胞术分析每种治疗方法接种NOD/SCID小鼠血液中143B-mCherry CTC的数量（每组15只小鼠）。**（F）**K7M2接种BALB/c小鼠经载体、olaparib、EZRi或olaparib/EZRi联合治疗后OS肿瘤和肺转移的典型图像。**（G）**用载体、olaparib、EZRi或olaparib/EZRi联合治疗的BALB/c小鼠原位K7M2肿瘤的重量（n=15只/组）。**（H）**每次治疗后接种K7M2的BALB/c小鼠肺部可见的转移性K7M2结节数量。**（一）**每次治疗后肺切片的典型H&E图像显示转移瘤。

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