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.2022年2月15日；135（4）：jcs259138。
doi:10.1242/jcs.259138。 Epub 2022年2月18日。

ALFY定位于早期内体和细胞突起，以促进细胞定向迁移

克里斯蒂安·瑟伦 1 2, 塞尔希·潘基夫 1 2, 卡米拉·博格斯马克 1 2, 埃伦·豪格森 2 三, 安妮特·达尔 1 2, 劳拉·德拉·巴利纳 1 2, 山本爱 4, 阿尔夫·H·利斯塔德 1 2, 安妮·西蒙森 1 2 5
附属公司

ALFY定位于早期内体和细胞突起，以促进细胞定向迁移

克里斯蒂安·瑟伦等。 细胞科学杂志. .

摘要

细胞迁移是一个复杂的生理和病理过程，如大脑发育和癌症转移。自噬相关FYVE蛋白（ALFY；也称为WDFY3）是一种促进蛋白质聚集物清除的自噬衔接蛋白，与小鼠大脑皮层神经发生期间的大脑发育和神经迁移有关。然而，ALFY在迁移过程中细胞运动和细胞外基质粘附中的特定作用尚未被研究。在这里，我们揭示了ALFY在内吞途径和细胞迁移中的新作用。我们发现ALFY以PtdIns（3）P依赖的方式定位于RAB5-和EEA1-阳性早期内体，并在迁移细胞的前沿和后缘高度富集于细胞突起。我们发现，缺乏ALFY的细胞附着减少，蛋白水平和整合素的糖基化改变，导致无法形成适当的前沿和失去定向细胞运动。

关键词：ALFY；内切体；病灶粘连；整合素；迁移；WDFY3。

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竞争利益作者声明没有竞争利益或财务利益。

数字

图1。
图1。
ALFY定位于细胞突起。（A） ALFY的域结构。ALFY包含一个长的N末端，随后是一个带有PH-BEACH-domain的保守C末端，五个WD重复序列，包括一个LC3-相互作用区域（LIR）和一个PtdIns（3）P-结合FYVE-domain。（B） 用四环素处理诱导表达EGFP–ALFY的HeLa细胞24小时 h和使用旋转圆盘共焦（左）或TIRF（右）成像模式实时成像。箭头突出细胞突起中积累的荧光信号。比例尺：10 微米。（C） 希拉牌手表KO1-1公司将稳定转染3×Flag–EGFP–ALFY的细胞进行100次活体成像 最小值箭头表示电池前端和后端的移动方向。比例尺：10 微米。（D） HeLa T-Rex FlpIN的蛋白质印迹重量和ALFYKO1-1公司CRISPR-Cas9产生的细胞系*表示非特定的蛋白质带。（E） HeLa T-Rex FlpIN的蛋白质印迹重量、ALFYKO1-1公司和ALFYKO1-1公司用多西环素处理或不处理拯救细胞以诱导EGFP-ALFY、LIR的表达多用途终端和FYVE多用途终端.*表示非特定带。B-E中的图像代表了三个实验。（F） ALFY公司KO1-1公司用强力霉素处理救援细胞系24小时 h诱导EGFP–ALFY、EGFP-ALFY LIR的表达多用途终端、EGFP–ALFY FYVE公司多用途终端、EGFP–ALFYΔWD40-FYVE和EGFP-ALFY△PH-BEACH，然后进行活细胞成像。EGFP-ALFY公司重量细胞是否用VPS34IN1处理2次 h（左侧面板）。箭头突出细胞突起中积累的荧光信号。比例尺：10 微米。（G） 量化F图像中突起中含有EGFP–ALFY的细胞百分比（%）（每个细胞系35–100个细胞的平均值±标准偏差）。
图2。
图2。
ALFY以PtdIns（3）P依赖性方式定位于早期内体。（A） ALFY公司KO1-1公司EGFP–ALFY救援细胞被固定，并针对EEA1进行免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。黄色（插图中为白色）箭头突出显示EGFP–ALFY结构，EEA1为正。共定位直方图来自标记线中的两个囊泡。（B） ALFY公司KO1-1公司稳定表达mScarlet-I–RAB5的EGFP–ALFY细胞用四环素处理过夜，并用肝细胞成像进行分析。mScarlet-I–RAB5-和EGFP–ALFY-阳性点用箭头表示，标记线的柱状图中显示了同位化。（C） 赫拉·阿尔菲KO1-1型使用EGFP–ALFY、EGFP-ALFY LIR抢救的细胞多用途终端或EGFP–ALFY FYVE多用途终端瞬时转染Myc–RAB5Q79升，固定为18 转染后h，针对Myc进行免疫染色，以显示RAB5第79季度共焦显微镜分析前的结构。指示Myc–RAB5的结肠化直方图Q79升结构如图所示。（D） ALFY公司KO1-1公司稳定表达mScarlet-I标记的LC3B的EGFP-ALFY细胞用四环素治疗并进行活体成像。从指示的结构中测量Colocalization。（E） ALFY公司KO1-1公司稳定表达mScarlet-I标记GABARAP的EGFP–ALFY细胞经四环素和活体成像处理。从指示的结构中测量Colocalization。图像是三个实验的代表。比例尺：10 微米。
图3。
图3。
定向细胞迁移需要ALFY。（A） HeLa创面愈合分析重量和ALFYKO1-1公司使用孵化器的细胞®活细胞成像系统。从三个独立实验的三个重复中量化平均相对伤口密度。左侧面板中用虚线方框标记的时间点显示为右侧的放大图（平均值±s.e.m。，n个=3). *P（P）<0.05，通过多重非配对双尾t吨-测试。（B） A中显示HeLa伤口密度的典型实验图像重量和ALFYKO1-1公司在0和28 h.图像显示1460×1970 微米。（C） 代表希拉运动的图形重量和ALFYKO1-1公司通过使用趋化和迁移工具（Ibidi）追踪实验图像中单个细胞获得的细胞，如A中的细胞。（D） 手动跟踪HeLa伤口愈合分析的图像重量，阿尔菲KO1-1公司、ALFYKO2-6型、ALFYKO2-9型和ALFYKO2-11型，显示了沿年-轴（平均值±s.e.m。，n个=3). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ****P（P）<0.0001（未配对双尾学生t吨-测试）。（E） HeLa前缘形成分析重量单元格，ALFYKO1-1公司细胞和ALFYKO1-1公司多西环素诱导EGFP–ALFY表达的救援细胞，针对皮质素进行免疫染色以标记前沿。白线表示引入的伤口。（F） 在前缘有皮质素的E细胞百分比（%）的量化。（平均值±标准误差。，n个=3). **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ns，不显著（非配对双尾学生t吨-测试）。
图4。
图4。
ALFY调节细胞粘附和整合素贩运。（A） 附加HeLa比例的量化重量和ALFYKO1-1公司，阿尔菲KO2-6型、ALFYKO2-9型和ALFYKO2-11型相对于野生型的细胞（用CellMask染色）（平均值±s.e.m。，n个=4）*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001（非配对双尾学生t吨-测试）。（B） HeLa整合素蛋白水平分析重量和ALFYKO1-1公司、ALFYKO2-6型、ALFYKO2-9型和ALFYKO2-11型细胞和ALFYKO2-9型EGFP–ALFY救援小组。这些斑点是三个独立实验的代表。（C） 希拉牌手表重量和ALFYKO2-9型是否用PNGaseF或CIP处理1次 37°C下放置h，然后使用所示抗体进行western blot分析。（D） ALFY的代表性活细胞图像KO2-9型EGFP–ALFY救援细胞，与整合素-α5–mScarlet-I共同表达。箭头表示两种结构均为阳性。比例尺：10 微米。C、D中的图像代表了三个实验。（E） ALFY在细胞迁移中的作用模型。ALFY定位于迁移细胞前缘和后缘的细胞突起，以及早期内体。通过存在于这些结构上，ALFY调节粘附蛋白（如整合素）的正确分类和双向运输，从而控制定向细胞迁移。
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