ALFY定位于早期内体和细胞突起，以促进细胞定向迁移

ALFY以PtdIns（3）P依赖性方式定位于早期内体

通过不同细胞质标记物的联合免疫染色分析EGFP–ALFY阳性结构的性质。令人惊讶的是，EGFP–ALFY与早期内体标记物EEA1和RAB5广泛共定位(图2A、 B类；电影1)，而检测到与晚期内体标记物RAB7或再循环内体标记物RAB11的动态“亲吻和奔跑”相互作用(图S1G、H,电影2,三). 我们在活细胞成像过程中注意到，EGFP–ALFY的亚细胞定位对温度高度敏感，因为用冷PBS洗涤细胞10天后，其对细胞突起的定位丢失 室温下的最小值(图S1I). 考虑到许多细胞内事件，包括内吞和分泌，在低温下受到抑制(Saraste等人，1986年;Tomoda等人，1989年)以及ALFY-FYVE结构域与PtdIns（3）含磷膜的弱结合(Reinhart等人，2021年)，ALFY向早期内体的募集可能是活性依赖性的。

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图2。

ALFY以PtdIns（3）P依赖性方式定位于早期内体。（A） ALFY公司^KO1-1公司EGFP–ALFY救援细胞被固定，并针对EEA1进行免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。黄色（插图中为白色）箭头突出显示EGFP–ALFY结构，EEA1为正。共定位直方图来自标记线中的两个囊泡。（B） ALFY公司^KO1-1公司稳定表达mScarlet-I–RAB5的EGFP–ALFY细胞用四环素处理过夜，并用肝细胞成像进行分析。mScarlet-I–RAB5-和EGFP–ALFY-阳性点用箭头表示，标记线的柱状图中显示了同位化。（C） 赫拉·阿尔菲^KO1-1公司使用EGFP–ALFY、EGFP-ALFY LIR抢救的细胞^{多用途终端}或EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}瞬时转染Myc–RAB5^Q79升，固定为18 转染后h，针对Myc进行免疫染色，以显示RAB5^Q79升共焦显微镜分析前的结构。指示Myc–RAB5的结肠化直方图^Q79升结构如图所示。（D） 阿尔菲^KO1-1公司稳定表达mScarlet-I标记的LC3B的EGFP-ALFY细胞用四环素治疗并进行活体成像。从指示的结构中测量Colocalization。（E） ALFY公司^KO1-1公司稳定表达mScarlet-I标记GABARAP的EGFP–ALFY细胞经四环素和活体成像处理。从指示的结构中测量Colocalization。图像代表了三个实验。比例尺：10 微米。

因为ALFY的LIR和FYVE域对其突起定位都不是必需的(图1F、 G），我们询问这些基序是否是ALFY向早期内体募集所必需的。海拉阿飞^KO1-1公司表达EGFP–ALFY、EGFP-ALFY LIR的细胞^{多用途终端}或EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}转染了组成性活性GTPase缺陷RAB5突变体（Myc–RAB5^Q79升)产生扩大的早期内体。EGFP–ALFY和EGFP-ALFY LIR^{多用途终端}被有效招募到Myc–RAB5^Q79升囊泡，同时补充EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}大大减少了(图2C） 表明ALFY向早期内体的募集需要其FYVE结构域，但与GABARAP的结合无关。EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}然而，是否局限于小型RAB5阴性结构(图2C类；图S2B)与VPS34IN1处理的细胞中存在EGFP–ALFY阳性结构一致(图1F） ●●●●。

如前所述(Simonsen等人，2004年;Lystad等人，2014年)，我们观察到EGFP–ALFY与自噬标记mScarlet-I–LC3B（LC3B也称为MAP1LC3B）的一些共定位(图2D） 和mScarlet-I–GABARAP(图2E） 而全长ALFY在基础条件下未能与自噬受体mScarlet-I–SQSTM1共定位(图S2A).

为了阐明ALFY的可能内体功能，我们分析了转铁蛋白（Tfn）的循环和Tfn受体（TfR）的降解，以及WT和ALFY中表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）和罗丹明EGF的降解^KO1-1公司细胞。而在ALFY中，Tfn再循环和TfR降解不受影响^KO1-1公司单元格(图S2C-E)，ALFY中EGFR和罗丹明-EGF的水平降低^KO1-1公司细胞与WT细胞的比较(图S2F–J)表明ALFY调节EGFR从早期内体到溶酶体的货物分类。

总之，我们表明EGFP–ALFY以PtdIns（3）P依赖的方式定位于早期内体，但它也独立于PtdIns（3）P被招募到细胞质结构。

定向细胞迁移需要ALFY

ALFY定位于迁移细胞的前缘和后缘，以及它在大脑皮层神经发生过程中的神经迁移作用，促使我们研究ALFY在细胞迁移中的作用。28例伤口愈合分析 h透露ALFY^击倒对手细胞显示伤口闭合减少(图3A、 B），但与HeLa相比增殖相似^重量单元格(图S3A)，表示ALFY^击倒对手细胞迁移能力减弱。通过手动跟踪单个细胞，我们发现ALFY^击倒对手细胞迁移速度比HeLa快^重量细胞，但缺乏方向性，因此无法迁移到伤口中(年-方向，FMLY）(图3C、 D类；图S3B). 这让人想起在ALFY KO小鼠中观察到的轴突寻路缺陷，即轴突对趋化性线索没有反应(Dragich等人，2016年).

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图3。

定向细胞迁移需要ALFY。（A） HeLa创面愈合分析^重量和ALFY^KO1-1公司使用孵化器的细胞^®活细胞成像系统。从三个独立实验的三个重复中量化平均相对伤口密度。左侧面板中用虚线方框标记的时间点显示为右侧的放大图（平均值±s.e.m。，n个=3). *P（P）<0.05，通过多重非配对双尾t吨-测试。（B） A中显示HeLa伤口密度的典型实验图像^重量和ALFY^KO1-1公司在0和28 h.图像显示1460×1970 μm。（C） 代表希拉运动的图形^重量和ALFY^KO1-1公司通过使用趋化和迁移工具（Ibidi）追踪实验图像中单个细胞获得的细胞，如A中的细胞。（D） 手动跟踪HeLa伤口愈合分析的图像^重量、ALFY^KO1-1公司、ALFY^KO2-6型、ALFY^KO2-9型和ALFY^KO2-11型，显示了沿年-轴（平均值±s.e.m。，n个=3). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ****P（P）<0.0001（未配对双尾学生t吨-测试）。（E） HeLa前缘形成分析^重量单元格，ALFY^KO1-1公司单元格和ALFY^KO1-1公司多西环素诱导EGFP–ALFY表达的救援细胞，针对皮质素进行免疫染色以标记前沿。白线表示引入的伤口。（F） 在前缘有皮质素的E细胞百分比（%）的量化。（平均值±标准误差。，n个=3). **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; ns，不显著（非配对双尾学生t吨-测试）。

此外，皮质素的补充，这是一种促进肌动蛋白分支的蛋白质，在细胞迁移过程中补充到细胞的前沿(Ammer and Weed，2008年)，在ALFY中被显著废除^KO1-1公司细胞与HeLa的比较^重量细胞，但通过EGFP–ALFY的表达拯救(图3E、 F），表明ALFY在细胞定向迁移过程中促进前缘的形成，与前缘细胞突起的富集相一致(图1C） ALFY的方向性降低^击倒对手单元格(图3C、 D类；图S3B).

抗体

以下主要抗体用于免疫荧光和/或免疫印迹：兔抗ALFY（1:1000；Novus Biologicals，NBP1-03332，Bethyl Laboratories，A301-869A，Abcam，ab84888，LSBio，Cat.No LS-C483076和Simonsen等人，2004年)抗EEA1（1:250，BD Biosciences，610457），抗Myc（1:500，Abcam，ab9132），抗rtactin（1:200，Millipore upstate，05-180），抗paxillin（1:1000，Abcan，ab32084），抗β-actin（1:1000；Cell Signaling Technology，#3700），反标志（1:1000、Sigma，F1804），抗GFP（1:1000），克隆泰克，#632381），抗整合素-α4（1:1000，细胞信号技术，8440T），抗整合酶-α5，抗整合素-β5（1:1000，细胞信号技术，3629T），抗EGFR（1:5000，Fitzgerald，20-ES04），抗转铁蛋白受体（1:5000、Zymed，13-6890），抗鼠IgG（Starright 700，BioRad，12004158），抗兔IgG，抗兔IgG（HRP，Jackson，ImmunoResearch 111-035-144）、抗鼠IgG、抗兔（DyLight 649、Jackson、ImmunoResearch 711-495-152）、抗小鼠IgG和抗山羊IgG。用Hoechst 33342（Invitrogen，H1399）进行DNA染色。

质粒和克隆

ALFY通过PCR从人类cDNA文库中扩增出四个片段（碱基对1–3028、2256–5425、5123–7570和7355–10581），并克隆到PCR blund II TOPO载体（Invitrogen）中。为了产生LIR和FYVE域突变体，使用QuikChange Lightning Multi-Site-Directed突变试剂盒（Agilent）对含有目标ALFY序列的构建物进行突变。带有或不带有LIR或FYVE突变的ALFY片段通过pENTR1A（Invitrogen）中的Gibson组装连接，生成全长ALFY。通过测序验证得到的全长ALFY插入物。缺乏PH-BEACH或WD40-FYVE结构域的ALFY构建物是通过从全长pENTR-ALFY中克隆限制性内切酶而生成的。使用来自pENTR1A-ALFY WT、LIR或FYVE突变体或ΔPH-BEACH-或ΔWD40-FYVE突变的网关重组克隆（Invitrogen）生成pDest-FlpIn-tdNGFlag-ALFY和pDest-FlpIn-EGFP-ALFY。通过将相应的cDNA限制性内切酶亚克隆到pLVX-puro慢病毒主干（Takara Bio）中，生成了用于稳定转染mScarlet-I–RAB5A、mScarlet-I–RAB7A、mScartlet-I-Rab11A、m斯卡勒-I–LC3B、mScaret-I–GABARAP和mScarlet-I–SQSTM1的载体。为了生成表达串联二聚体NeonGreen的Gateway目的载体（pDestFlpIn-tdNGFlag），合成了编码两个NeonGreen3×Flag标签拷贝的cDNA作为连接子序列从头开始（ThermoFisher GeneArt基因合成）并将其克隆到pDestFlpInHA载体中，而不是HA标签。pLVX-paxillin-mScarlet-I和pLVX-整合素α5-mScarlet-I由Gibson组装产生。所有构建体均通过Sanger测序进行验证。pCMV-VSV-G为Addgene质粒#8454（保藏人Bob Weinberg），psPAX2为Addgene质粒#12260（由Didier Trono存放）。pcDNA3-myc-RAB5-WT和-Q79L质粒是挪威奥斯陆大学医院癌症研究所的Harald Stenmark教授赠送的礼物。

病毒的产生和转导

10⁶HEK-FT细胞在10 cm培养皿，第二天用1.6 μg pCMV-VSV-g、psPAX2和转移质粒。24天后更换培养基 收集含h和慢病毒的培养基，并通过Acrodisc 0.45进行过滤 48和72处的µm超膜注射器过滤器 转染后h。对于细胞感染，10⁵HeLa或U2OS细胞被镀在六孔板的孔中，第二天将细胞培养基更换为2 ml新鲜培养基，含0.5 ml含有慢病毒的培养基和8 µg/ml聚brene（圣克鲁斯生物技术公司）。介质已更改24 含2的新鲜培养基感染后h μg/ml嘌呤霉素。将嘌呤霉素选择的细胞池用于实验。

稳定转染细胞系的产生

赫拉霸王龙^重量、ALFY^击倒对手用pOG44 Flp重组酶表达载体（Invitrogen）和pDEST-FlpIN-EGFP-ALFY、LIR联合转染U2OS细胞^{多用途终端}，年^{多用途终端}、ΔPH-BEACH或ΔWD40-FYVE（用于HeLa细胞）或pDest-FlpIN-tdNGFlag-ALFY（用于U2OS细胞），比例为10:1，使用X-tremeGene9 DNA转染试剂（Roche，XTG9-RO）。24点 转染后h，细胞分裂为4个10 容量为200厘米的盘子和培养基 添加µg/ml Hygromycin B（VWR）以选择含有稳定整合到基因组中的感兴趣基因的细胞。选择单个克隆2 选择周后，通过western blotting和共焦成像检测EGFP–ALFY的表达。mScarlet-I–RAB5A、mScarlet-I–RAB7A、mScaret-I–RAB11A、mScar let-I-LC3B、mScartlet-I—GABARAP、mScarmet-I–SQSTM1和paxillin–mCarlet-I是通过感染慢病毒颗粒产生的，如病毒产生和转导部分所述。Lipofectamine 2000（Invitrogen，11668019）用于瞬时转染。

CRISPR/Cas9诱导ALFY KO细胞系的建立

为了产生ALFY KO细胞系，按照Zhang lab克隆方案制作了CRISPR质粒(Ran等人，2013年). 使用crispr.mit.edu crispr设计工具设计了两个独立的单导向RNA（#1，5′-GATCGGGAGCTTTAGAGG-3′；#2，5′-GCAGAGTGAAGCAGTAG-3′），并从Sigma(图S1D). 将引导物克隆到hSpCas9-2A-Pro V2.0（px459）质粒（Addgene#62988)并根据制造商的协议，使用X-tremeGene9转染试剂（Roche）转染HeLa TRex FlpIN细胞。24小时后，用含有2.0 μg/ml嘌呤霉素。3之后 第天，将耐嘌呤霉素细胞以每孔单细胞密度接种在96周的平板中，通过连续稀释。对几个克隆进行了测试，并通过western blotting对敲除的克隆进行了确认。

细胞裂解和蛋白质印迹

对于western blot分析，在裂解缓冲液（150 mM NaCl，1%Triton®声波风廓线仪X-100，1 mM EDTA和50 mM Tris-HCl pH 7.4），补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，05056489001）10 冰块上的最小值。裂解产物在15000下离心克用于10 用BCA蛋白测定法（Pierce，23225）测量上清液的蛋白浓度，以确保SDS-PAGE上的装载量相等。SDS-PAGE后，使用一级抗体和荧光团或HRP结合的二级抗体进行蛋白质印迹，以便使用Chemidoc™MP成像系统（BioRad）进行检测和分析。检测前，将含有HRP-结合抗体的膜与Supersignal™West Dura Extended duration底物（Thermo Fisher Scientific，34075）孵育5 最小值。

对于EGFR的蛋白印迹，细胞被血清饥饿2 用50 ng/ml EGF（Santa Cruz Biotechnology，sc-4552）用于指定时间点。随后，如上文所述，对细胞进行裂解并制备用于蛋白质印迹。

用于PNGaseF和小牛肠磷酸酶（CIP）治疗，3×10⁵HeLa WT或ALFY KO^2-9细胞被镀在六孔板的孔中，并在100个孔中溶解 50µl/孔 mM Tris-HCl pH值7.5150 mM NaCl，次日1%Triton X-100。细胞裂解物在12000℃离心分离 克用于5 PNGaseF处理的最小值，9 将µl细胞裂解物与1 微升糖蛋白变性缓冲液（NEB，B1704S），加热至100°C 10 分钟，然后在冰上冷却，补充2 µl的10×GlycoBuffer2（NEB，B3704S），2 微升10%NP40，1 µl PNGaseF（NEB，P0709S）和5 微升水，孵育1小时 37°C时为h。用于CIP治疗，9 μl细胞裂解液中补充1.1 µl 10×NEBuffer2和1 微升CIP（NEB，M0290S）并孵育1 37°C时为h。

免疫沉淀

为了进行免疫沉淀，细胞在含有150 mM NaCl，1%Triton®声波风廓线仪X-100和50 mM Tris-HCl pH 8.0，添加完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，05056489001）（500 微升/10 cm培养皿）。将裂解产物在4°C下旋转培养30 min。在16000℃下离心裂解产物克用于10 在4°C下孵育分钟，并将上清液与5 µl抗ALFY抗体在4°C下旋转过夜。通过添加20 µl蛋白G Dynabeads（Invitrogen，10003D）至1的裂解物 h在4°C下旋转。使用DynaMag磁铁（12321D）收集结合蛋白，并在裂解缓冲液中洗涤三次。用PBS清洗珠子两次，并在50分钟内重新悬浮 µl PBS，然后进行质谱分析或western blot分析。

转铁蛋白回收和流式细胞术分析

为了测量Tfn循环，首先将WT和ALFY KO电池置于冰上10 分钟，用10进行治疗前 µg/ml Alexa Fluor 555结合Tfn（Invitrogen，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“T35352”，“term_id”：“617450”}}T35352电话)用于15 min。然后用PBS清洗细胞，并在37°C的细胞培养条件下追踪指定的时间段。追逐后，将细胞胰蛋白酶化，用4%多聚甲醛（PFA）固定，离心3 500时最小值克使细胞颗粒化。细胞在PBS中清洗，并通过与5 ml试管（猎鹰，352235）。使用Acea Biosciences的NovoCyte流式细胞仪通过流式细胞术分析细胞。

罗丹明–EGF降解分析

用50 ng/ml罗丹明–EGF（Invitrogen，E348）15 37°C时最小值，然后是60、30或0 用4%PFA（Polysciences，18814-10）固定15分钟 冰块上的最小值。将1×PBS添加到每个孔中，并使用Andor Dragonfly 505旋转圆盘共聚焦显微镜使用NIKON Apo TIRF 60×/1.49 NA浸油物镜获取罗丹明–EGF的图像。通过获取一系列具有0.3的z堆栈来成像整个细胞体积 µm轴向距离。对于罗丹明-EGF的图像分析，z（z）-用叠加最大强度投影法分割细胞中的罗丹明–EGF囊泡。使用CellProfiler定量罗丹明–EGF阳性囊泡的平均计数和大小（面积）（v.4.1.3）(Carpenter等人，2006年).

免疫荧光、共焦显微镜和共定位分析

细胞在玻璃盖玻片上或玻璃底部8孔室中生长，并在4%多聚甲醛（PFA；Polysciences，18814-10）中固定前按所述处理15 室温下的最小值。PFA在0.05时淬火 M NH公司₄Cl代表10 分钟，然后渗透5 添加0.05%皂苷的PBS中的最小值。通过将固定细胞与指定的初级和相应的次级抗体孵育在含有0.05%皂苷的PBS中进行免疫染色。随后对细胞进行10次染色 最小值为1 g/ml Hoechst 33342在PBS中稀释。盖玻片安装在Prolong Diamond Antifade Mountant中（Invitrogen，第36965页）。使用带有63倍物镜的蔡司LSM 710共焦显微镜对细胞进行分析。

使用ImageJ（斐济）生成彩色化直方图，方法是在感兴趣的结构中画一条线，并使用曲线图函数获得每个像素的灰度值（强度）。为了生成图形，绘制了两个重叠通道的强度。

活细胞成像

在装有Okolab细胞培养箱的Andor Dragonfly 505高速共焦平台上，在FluoreBrite DMEM培养基（Gibco）中对八孔Lab-Tek II室盖玻璃中生长的细胞进行实时成像，该培养基配备有温度、CO₂和湿度控制，使用NIKON Apo TIRF 60×/1.49 NA油浸物镜。旋转圆盘共焦模式用于所有图形，除了图1B、 右侧面板，其中TIRF模式为100 采用nm穿透深度。

伤口愈合分析和定向分析

细胞接种在96周的ImageLock™板中（Essen Bioscience）。当细胞成为融合的单层时，使用创伤制造工具（Essen Bioscience）进行创伤。为了清除细胞碎片，更换培养基，然后将培养板置于培养箱中^®S3用于成像的活细胞显微镜（Sartorius）。每10口井采集一张图像 28分钟 h监测细胞向伤口的迁移。使用孵化器量化相对伤口密度^®软件S3（Sartorius），测量每个时间点伤口区域内的空间细胞密度相对于伤口区域外的空间细胞浓度。使用三个独立实验的三个重复孔的平均值，将数据表示为平均相对伤口密度。

使用ImageJ软件和Manual tracking插件以及Chemotaxis and Migration工具（ibidi GmbH）对伤口愈合分析中的细胞进行手动跟踪。通过将欧几里得距离除以ibidi趋化和迁移工具获得的累积距离来计算细胞的持久性。

为了使用免疫荧光对细胞进行定向分析，细胞生长在带有500 µm电池自由间隙（ibidi）。移除插入物，并将细胞在新鲜培养基中培养4-5 h、 在固定和染色之前，如前所述标记前缘。为了通过共焦成像进行分析，从三个独立的实验中采集了5-10张图像。为了进行量化，手动计数前缘为皮质素阳性的细胞，并将其与每个视野中的细胞总数进行比较，同时对每个条件下的60-100个细胞进行计数。

细胞增殖试验

根据制造商的说明，使用细胞增殖和细胞毒性试剂盒（Boster，AR1156），使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析法测量细胞增殖。在96孔板中以不同的细胞密度将细胞接种成三份。24点 播种后h，将MTT加入培养基中，静置4小时 h，使有活力的增殖细胞形成紫色的不溶性甲zan晶体。将晶体溶解过夜，并通过测量560的光密度来测定所得有色溶液的浓度 纳米。

细胞附着试验

对不同的细胞系进行胰蛋白酶化，并用CellMask™深红色质膜染色（Invitrogen，{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C10046”，“term_id”：“1535117”}}10046元)然后在96周的培养皿中播种（每个细胞系重复6次）。细胞孵育30 在PBS中进行三次清洗以去除未附着的细胞之前，使细胞附着在井底。使用700激光使用Odyssey CLx成像仪扫描96周板，并使用Image Studio™软件量化每个孔的总强度，作为剩余细胞的测量值。

我们感谢Farhan实验室和Blomhoff实验室（奥斯陆大学基础医学研究所）分别在孵化细胞和流式细胞仪分析的初始设置方面提供的帮助。