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.2022年1月；26(1):60-74.
doi:10.1111/jcmm.16982。 Epub 2021年12月2日。

LncRNA SNHG1通过与PTBP1相互作用促进DNMT1介导的Opg高甲基化，从而调节BMSCs的脂肪分化

小雨 1 2, 孟圣松 三, 彭泽荣 三, 陈贤军 1 2, 林氏 1 2, 王成浩 1 2, 清江庞 1 2
附属公司

LncRNA SNHG1通过与PTBP1相互作用促进DNMT1介导的Opg高甲基化，从而调节BMSCs的脂肪分化

小雨等。 细胞与分子医学杂志. 2022年1月.

摘要

最近的证据表明，骨髓间充质干细胞（BMSCs）的异常分化在骨质疏松症的发病机制中起着关键作用。已发现LncRNA SNHG1与BMSCs的分化能力有关。在本研究中，我们旨在阐明lncRNA SNHG1及其相关通路在骨质疏松症骨髓基质细胞分化中的作用。采用双侧卵巢切除（OVX）小鼠作为骨质疏松模型。在小鼠骨髓间充质干细胞中进行诱导成骨或成脂分化。与假动物相比，在OVX小鼠中lncRNA SNHG1表达上调。此外，SNHG1在成脂性BMSCs中的体外表达增加，但在成骨性BMSC中的表达降低。此外，SNHG1的过度表达增强了BMSCs的成脂能力，但抑制了其成骨能力，如油红O、茜素红和碱性磷酸酶染色所确定的，而SNHG1的沉默则导致相反的结果。LncRNA-SNGG1与RNA结合多肽结合蛋白1（PTBP1）相互作用，通过介导DNA甲基转移酶（DNMT）1促进骨保护素（Opg）甲基化并抑制Opg表达。此外，Opg被证明可以调节BMSC的分化。SNHG1的敲除降低了成脂相关基因的表达，但增加了成骨相关基因的表达。然而，击倒Opg部分逆转了这些影响。总之，lncRNA SNHG1通过与PTBP1相互作用上调DNMT1的表达，导致Opg超甲基化并降低Opg表达，从而增强BMSC的成脂分化并导致骨质疏松。

关键词：DNMT1；LncRNA SNHG1；PTBP1；间充质干细胞；骨质疏松症；护骨素。

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利益冲突声明

提交人确认，不存在利益冲突。

数字

图1
图1
LncRNA SNHG1与骨质疏松症的BMSC分化相关。用qPCR检测以下样品的LncRNA SNHG1表达：（A，B）OVX和羞耻小鼠的骨组织和血清；（C） 骨质疏松症患者的骨组织与对照组；（D） 脂肪诱导剂和生长介质处理的骨髓间充质干细胞；（E） 经成骨诱导剂和生长介质处理的骨髓间充质干细胞。AM，脂肪诱导培养基；NM，正常生长培养基；OM，成骨诱导培养基。使用Student’s吨‐测试**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001
图2
图2
LncRNA SNHG1增强BMSC成脂分化，但抑制BMSC成骨分化。用pcDNA‐SNHG1或空载体转染BMSCs。（A） 转染pcDNA‐SNHG1或空载体的BMSCs的LncRNA SNHG1表达；（B） 用代表性图像计算ORO染色后的脂肪细胞密度；（C） qPCR检测Opg、Runx2、Ppar‐γ、Fabp4、ALP、Bmp4、Bglap和Cebpa的mRNA表达；（D） Ppar‐γ的免疫荧光染色；（E） western blot检测Opg、Runx2、Ppar‐γ和Fabp4蛋白水平；（F） 用所表示的图像进行ARS染色后的ARS吸光度；（G） 用所示图像进行ALP染色后的ALP吸光度。使用学生的吨‐测试*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001
图3
图3
沉默lncRNA SNHG1抑制BMSC脂肪分化，但促进BMSC成骨分化。骨髓间充质干细胞转染sh-SNHG1或sh-NC。（A） 转染sh-SNHG1或sh-NC的BMSCs的LncRNA SNHG1表达；（B） 用代表性图像计算ORO染色后的脂肪细胞密度；（C） qPCR检测Opg、Runx2、Ppar‐γ、Fabp4、ALP、Bmp4、Bglap和Cebpa的mRNA表达；（D） Ppar‐γ的免疫荧光染色；（E） western blot检测Opg、Runx2、Ppar‐γ和Fabp4蛋白水平；（F） 用代表图像进行ARS染色后的ARS吸光度；（G） 用代表图像进行ALP染色后的ALP吸光度。使用Student’s吨‐测试*第页 < 0.05; **第页 < 0.01
图4
图4
LncRNA SNHG1与PTBP1相互作用并促进PTBP1的表达。（A） 骨髓基质干细胞中SNHG1的FISH（红色）。DAPI染色图像为蓝色；（B） 通过qPCR分离MSCs中的SNHG1。U6和GAPDH分别作为核和细胞质对照；（C） 合成的生物素化正反义SNHG1探针；（D） RNA下拉，然后进行蛋白质印迹。BMSC裂解物与正反义生物素标记的SNHG1探针孵育。下拉后，用western blot检测探针招募的PTBP1；（E） RIP分析使用抗PTBP1抗体检测PTBP1和SNHG1之间的相互作用。SNRP70或正常IgG分别作为阳性和阴性对照。（F） 通过qPCR检测转染pcDNA-SNHG1/空载体或sh-SNHG1/sh-NC的BMSCs中PTBP1的mRNA表达；（G） 用pcDNA‐PTBP1/空载体或sh‐PTBP1/sh‐NC转染的BMSCs中PTBP1的蛋白质水平。各组之间的比较使用Student的吨在适当的情况下，通过事后分析进行检验或单向方差分析**第页 < 0.01
图5
图5
LncRNA SNHG1与PTBP1相互作用并促进DNMT1的表达。（A） 应用qPCR检测脂肪分化诱导剂处理14天的骨髓间充质干细胞PTBP1和DNMT1的mRNA表达；（B，C）qPCR检测PTBP1的mRNA表达；（C） western blot检测PTBP1蛋白水平；（D） 用qPCR检测DNMT1的mRNA表达；（E） 用qPCR检测不同转染方案的各组DNMT1 mRNA的表达。NM，正常生长培养基；AM，脂肪诱导培养基。使用Student’s吨测试或单向方差分析，适当时进行事后分析*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001
图6
图6
LncRNA SNHG1增强Opg甲基化以抑制Opg的表达。（A）经脂肪分化诱导剂处理14天的骨髓间充质干细胞中Opg mRNA的qPCR表达；（B） MSP分析检测Opg甲基化状态；（C） qPCR检测转染pcDNA-SNHG1/空载体或sh-SNHG1/sh-NC的BMSCs中Opg的mRNA表达；（D） 通过western blot检测转染pcDNA-SNHG1/空载体或sh‐SNHG1/sh‐NC的BMSCs中Opg的蛋白水平；（E，F）5-Aza治疗96 h后，pcDNA-SNHG1或空载体转染BMSCs中Opg的mRNA表达和蛋白水平；（G） MSP分析检测5-Aza治疗96小时后pcDNA-SNHG1或空载体转染MSCs中Opg的甲基化状态。NM，正常生长培养基；AM，脂肪诱导培养基。使用Student’s吨测试或单向方差分析，适当时进行事后分析*第页 < 0.05; **第页 < 0.01
图7
图7
Opg调节BMSCs的细胞分化。用pcDNA‐Opg/空载体或sh‐Opg/sh‐NC转染BMSC。（A） 用所表示的图像进行ORO染色后计算的脂肪细胞密度；（B） 通过qPCR检测Opg、Runx2、Ppar‐γ、Fabp4、ALP、Bmp4、Bglap和Cebpa的mRNA表达；（C） Ppar‐γ的免疫荧光染色；（D） western blot检测Opg、Runx2、Ppar‐γ和Fabp4蛋白水平；（E） 用代表图像进行ARS染色后的ARS吸光度；（F） 用代表图像进行ALP染色后的ALP吸光度。使用单因素方差分析和事后分析进行比较*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001
图8
图8
LncRNA SNHG1沉默可在体内改善骨质疏松症。通过尾静脉用sh‐SNHG1和/或sh‐Opg治疗OVX小鼠3周。（A） qPCR检测SNHG1和Opg mRNA的表达；（B） 小鼠股骨的血红素和曙红染色；（C） qPCR检测Col1a1、Runx2、Ppar‐γ、ALP、Bmp4、Bglap和Fabp4的mRNA表达；（D） western blot检测Runx2、Ppar‐γ和Fabp4蛋白水平。使用单因素方差分析和事后分析进行比较*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001
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