SUMOylation regulates Rb hyperphosphorylation and inactivation in uveal melanoma

doi:10.1111/cas.15223

.2022年2月；113(2):622-633.

doi:10.1111/cas.15223。 Epub 2021年12月20日。

SUMO酸化调节葡萄膜黑色素瘤中Rb的过度磷酸化和失活

凤熙梦^1 2 三, Yiqun Yuan^1 2 三, 惠仁^1 2 三, 韩越^1 2 三, 徐斌斌（Binbin Xu）^1 2 三, 姜倩^1 2 三

附属公司

¹复旦大学眼科与耳鼻喉科医院眼科，上海，中国。
²中国医学科学院近视实验室，上海，中国。
^三复旦大学NHC近视重点实验室，上海，中国。

PMID： 34839558
预防性维修识别码： PMC8819297
内政部： 10.1111/箱15223

SUMO酸化调节葡萄膜黑色素瘤中Rb的过度磷酸化和失活

凤熙梦等。癌症科学. 2022年2月.

.2022年2月；113(2):622-633.

doi:10.1111/cas.15223。 Epub 2021年12月20日。

作者

凤熙梦^1 2 三, Yiqun Yuan^1 2 三, 惠仁^1 2 三, 韩越^1 2 三, 徐斌^1 2 三, 姜倩^1 2 三

附属公司

¹复旦大学眼科与耳鼻喉科医院眼科，上海，中国。
²中国医学科学院近视实验室，上海，中国。
^三复旦大学NHC近视重点实验室，上海，中国。

PMID： 34839558
预防性维修识别码： PMC8819297号
内政部： 10.1111/箱15223

摘要

小泛素样修饰物（SUMO）的修饰是一种翻译后修饰，与多种肿瘤类型有关。SUMO酸化的调节可以影响肿瘤的进展，但其潜在机制尚不清楚。在这里，我们首次表明，在成人最常见的眼内恶性肿瘤葡萄膜黑色素瘤（UM）中，全局SUMO化上调并参与肿瘤生长。UM中SUMO化的抑制足以在体外和体内减少肿瘤生长。此外，我们发现视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，Rb）是UM中SUMO酸化活性上调的靶蛋白和关键下游效应器。Rb蛋白SUMO化增加导致其在UM细胞中过度磷酸化和失活，促进UM细胞增殖。总之，我们的结果为SUMOylation调节UM肿瘤生长的机制提供了新的见解。

关键词：Rb；SUMO化；银杏酸；磷酸化；葡萄膜黑色素瘤。

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数字

图1
葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞株中的全局小泛素样修饰物（SUMO）酸化增加。A、通过SUMO1免疫印迹法测定了10个UM细胞系、两个原代培养的人成纤维细胞和一个永生化的人葡萄膜黑素细胞系中的高分子量（HMW）SUMO结合物水平。B、（A）中所示数据的量化。C、 UM和远端正常脉络膜组织中HMW SUMO化水平的测定如（A）所示。D、（C）中所示数据的量化

图2
增强的小泛素样修饰物（SUMO）酸化促进葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞生长并抑制凋亡。A、用两个短发夹RNA（shRNAs）转导三个指示的UM细胞株以对抗SUMO1或非靶向对照（NC）shRNA 72小时。通过免疫印迹法测定SUMO1水平。B、对用shRNA转导的UM细胞进行细胞生长测定（B）或集落形成评估（C）。D、用指示浓度的银杏酸（GA）处理UM细胞24小时，并进行SUMO1免疫印迹分析。E、 F，72小时细胞生长的代表性图像（E）和量化（F），有无GA处理。G、用50μmol/L GA处理UM细胞24 h。用碘化丙啶染色和流式细胞术评估细胞周期进展。H、 annexin V染色检测50μmol/L GA处理UM细胞的凋亡率

图3
银杏酸（GA）抑制小分子泛素样修饰物（SUMO）的酰化抑制抑制体内肿瘤生长。A、用GA或生理盐水治疗24天的裸鼠中来自葡萄膜黑色素瘤（UM）OCM3细胞的异种移植瘤体积。B、记录小鼠的体重。C、生理盐水或GA治疗组在结束时间点异种移植瘤的代表性图像和重量。比例尺，1厘米。D、 Ki67肿瘤异种移植物免疫组织化学染色的代表性图像。显示Ki67阳性细胞的百分比。E、异种肿瘤移植的苏木精-伊红染色的代表性图像。显示坏死区域的百分比

图4
视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在葡萄膜黑色素瘤（UM）中显著过度磷酸化和失活。A、 Rb免疫荧光染色的代表性图像和UM及周围正常脉络膜的亮场图像。B、（A）样品中Rb阳性细胞的百分比。C、 D，通过免疫印迹法测定UM和远端正常脉络膜组织（C）或显示的UM或非UM细胞系（D）中的总Rb蛋白水平（Rb组）和超磷酸化Rb水平（Ser 807/811；ppRb组。显示了低磷酸化Rb（Rb）和高磷酸化Rb（ppRb）的位置（D）

图5
视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在葡萄膜黑色素瘤（UM）中的抗增殖潜能被构成性抑制。A、 western blot分析了两种Rb短发夹RNA（shRNAs）在三种UM细胞株中的敲除效率。NC，非目标控制。B、用指示的shRNAs（B）或Rb或绿色荧光蛋白对照物（C）转导的C，UM细胞接受细胞生长测定。D、用Rb-His转导葡萄膜黑素细胞和指示的UM细胞系，并使用镍-硝基三乙酸-琼脂糖珠将Rb-His拉下。通过western blot检测Rb的总形式或高磷酸化形式。显示了低磷酸化Rb（Rb）和高磷酸化Rb（ppRb）的位置

图6
视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）小泛素样修饰物（SUMO）的下调降低了葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞系中的磷酸化水平。A、在变性RIPA缓冲液中裂解葡萄球菌黑素细胞和三株UM细胞系，用Rb抗体免疫沉淀，并用SUMO1和Rb抗体进行免疫印迹检测。B、按照A.C、D、总Rb或过磷酸化形式的Rb测定了经或不经银杏酸（GA）处理24小时的三种UM细胞系中的Rb‐SUMO1物种，这三种细胞系用指定浓度的GA处理24小时（C），或用SUMO1 shRNA（D）转导的两种UM电池系通过western blot检测

图7
视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的小泛素样修饰物（SUMO）酸化缺陷在葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞系中恢复其抗增殖作用。A、用His标记的野生型或SUMO缺陷突变体（K720R）Rb转导两个UM细胞系，并进行下拉程序。通过western blot测定下拉框中异位His标记Rb蛋白的总形式或过度磷酸化形式。B、用野生型或突变型Rb‐His转导的两个UM细胞系进行细胞生长测定。C、将靶向Rb蛋白的shRNA转导给两个UM细胞系表达突变体Rb‐His，然后进行细胞生长分析。Rb‐His水平通过免疫印迹法测定。D、表达野生型或突变Rb-His的指示UM细胞系的细胞生长分析，有或没有银杏酸（GA）处理

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