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。2021年10月14日；24(11):103274.
doi:10.1016/j.isci.2021.103274。 电子收款2021年11月19日。

泛素化跨膜货物的HD-PTP和ESCRT-0相互依赖的内体分选需要内啡肽

贾拉尔·M·喀山 1 2, 纪尧姆·德罗切斯 1 2, 克莱尔·马丁 三, Hyenju Jeong公司 1 2, 德米特里·卡里蒂迪 1 2, Pirjo M Apaja公司 4, 阿里尔·罗尔丹 4, 尼科尔·圣丹尼斯 三, 安妮·克劳德银杏 三 5, Gergely L Lukacs公司 2 4, Arnim暂停 1 2
附属公司

泛素化跨膜货物的HD-PTP和ESCRT-0相互依赖的内体分选需要内啡肽

贾拉尔·M·喀山等人。 i科学。 。

摘要

内化和泛素化的信号受体在运输（ESCRT）机械所需的内质体分选复合体的辅助下，通过其在管腔内萌芽进入多泡体而沉默。HD-PTP是一种ESCRT蛋白，与ESCRT-0、-I和-III蛋白形成复合物，并与Endofin结合，后者是一种限制在内切体中的FYVE域蛋白，其作用知之甚少。通过近距离生物素化，我们发现内啡肽与ESCRT成分形成复合物，内啡肽的缺失通过阻碍其溶酶体传递，增加了整合素α5和EGF受体的质膜密度和稳定性。这与持续的受体信号和增加的细胞迁移相一致。用野生型Endofin或HD-PTP补充Endofin-或HD-PTP-depleted细胞，但不与含有受损Endofin/HD-PTP关联或细胞溶质Endofin的突变体互补，恢复EGFR溶酶体递送。Endofin还促进Hrs与HD-PTP的间接相互作用。总之，我们的结果表明，HD-PTP和ESCRT-0对泛素化跨膜货物进行相互依赖的分类需要使用内啡肽，以确保有效的受体脱敏和溶酶体传递。

关键词：生物科学；细胞生物学；分子生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

无
图形摘要
图1
图1
Endofin与ESCRT和EGF受体（a）形成复合物，BioID屏幕的点图显示ESCRT蛋白与HD-PTP和Endofin。将旗帜标记的生物素连接酶（BirA*）融合到HD-PTP和Endofin的N-或C-末端，并用作诱饵。将构建物转染到Flp-In T-REx 293T细胞中。点图中的填充阴影表示平均光谱计数（Avg Spec），点的大小表示所有猎物的相对丰度，外圆颜色表示BFDR值。（B） 与模拟转染细胞相比，对瞬时转染myc-Endofin的293T细胞进行共免疫沉淀（Co-IP）。免疫沉淀Myc-Endofin（Myc抗体），用Western blots检测HD-PTP、ESCRT-0（Hrs和STAM2）和ESCRT-I（Tsg101和UBAP1）的co-IP。加载全细胞裂解液（WCL）以显示蛋白质含量。显示了小时的低暴露（LE）和高暴露（HE）免疫印迹。数据来自n=3个独立实验。（C） TurboID屏幕的点图显示了在存在或不存在EGF刺激的情况下（100 ng/mL，15分钟），ESCRT蛋白和其他与内吞作用和EGFR激活密切相关的蛋白。将快速反应的小Turbo生物素连接酶（MT）融合到EGFR的C末端（EGFR-MT），转染到T-REx-HeLa细胞中的Flp-In细胞并用作诱饵。
图2
图2
Endofin介导整合素α5、EGFR和CD4多-泛素化货物模型的有效分选，使其向Endofin-和HD-PTP-depleted HeLa细胞中总受体水平的溶酶体降解（A）整合素A 5（左面板）和EGFR（右面板）环己酰亚胺追逐（10μg/mL CHX）方向发展。细胞需要血清（2 h），用CHX预处理（1 h），然后用纤维连接蛋白（10μg/mL FN，37°C）或EGF（50 ng/mL，37°C）激活受体。整合素α5被追踪0、3和6小时，而EGFR在CHX存在下追踪0、2和4小时。对照细胞也用Bafilomycin A1（200 nM Baf+CHX，1 h）预处理，以抑制溶酶体酸化，从而抑制溶酶体降解（6 h FN+Baf或4 h EGF+Baf）。利用ImageJ软件对细胞提取物进行蛋白质印迹，通过密度分析测定降解动力学。整合素α5和EGFR水平归一化为eEF2。（B） 用细胞表面ELISA（cs-ELISA）测定HeLa细胞中整合素α5（左侧）和EGFR（右侧）质膜（PM）的稳定性。血清饥饿后，用纤维连接蛋白（10μg/mL FN，4 h，37°C）或EGF（50 ng/mL，20 min，37°C）激活受体。α5β1整合素阻断抗体（10μg/mL）和吉非替尼（2μM）作为阴性对照，阻断Endofin-depleted细胞的受体内化。对于每个细胞系，整合素α5和EGFR的水平绘制为细胞表面与未刺激细胞相比剩余的百分比。（C） 在缺乏血清的HeLa细胞上进行cs-ELISA，以量化稳定状态下整合素α5（左侧面板）和EGFR（右侧面板）PM受体密度。将内皮素和HD-PTP-depleted细胞与对照NT细胞进行比较。（D） （上面板）受体转运期间囊泡pH值变化的示意图（EE：早期内体，RE：再循环内体，LE：晚期内体，Lys：溶酶体）。（下面板）血清饥饿HeLa细胞中EGFR和整合素α5内吞动力学的FRIA分析。与NT细胞相比，在Endofin-、HD-PTP-和Hrs耗竭的HeLa细胞中，通过FRIA测定的含有FITC标记的EGFR-或整合素α5-的内吞囊泡的平均囊泡pH。血清饥饿后，用EGF（50 ng/mL，30或60 min，37°C）或FN（10μg/mL，4 h，37°C）刺激细胞。（E） 用CD4Tl（溶酶体降解受体分选的阴性对照）或CD4Tl泛素嵌合体（CD4Tl-Ub，作为多泛素化货物的模型）瞬时转染Endofin-和HD PTP耗竭的293T细胞。用CHX（100μg/mL）预处理血清饥饿的293T细胞，以追踪CD4Tl和CD4Tl-Ub的总蛋白水平2 h。用ImageJ软件对细胞提取物进行蛋白质印迹（CD4抗体），以通过密度分析测量降解动力学。CD4Tl和CD4Tl-Ub水平归一化为eEF2。（F和G）（F）在15、30、60和120分钟追踪（37°C）后，通过FRIA测定Endofin-depleted HeLa细胞与NT细胞中含有CD4Tl-Ub-和（G）CD4TCC-UbAllRΔG的内吞小泡的平均小泡pH值。CD4TCC-UbAllRΔG是四聚体单-泛素化货物的模型。数据为n≥3个独立实验的平均值±SEM。未配对学生t检验：*p<0.05，*p<0.01，***p<0.001。
图3
图3
Endofin促进HD-PTP与EGFR、Hrs和CHMP4B（A）Co-IP在EGF刺激下（50 ng/mL，15 min，37°C）对对照组和Endofin-depleted 293T细胞进行共定位。免疫沉淀内源性HD-PTP，Western blotting评估Hrs的co-IP。加载全细胞裂解液（WCL 1%）以显示蛋白质含量。（B–D）（B和C）利用HD-PTP对Endofin-depleted HeLa细胞中的EGFR（B）、Hrs（C）和CHMP4B（D）进行Colocalization分析。用EGF（50 ng/mL，5 min，37°C）刺激血清饥饿的细胞，然后在37°C下追踪EGFR 0，10，20和30 min。使用ImageJ软件（n=30）量化Mander的结肠化系数（MCC）。每个时间点都显示有代表性的免疫荧光图像。数据为n≥3个独立实验的平均值±SEM。未配对学生t检验：*p<0.05，*p<0.01，***p<0.001。
图4
图4
在（A）暂时与mCherry质粒和Flag-tagged WT-共转染的Endofin-depleted HeLa细胞中，在EGFR追踪30分钟后（50 ng/mL EGF，37°C），通过FRIA测定FITC-标记的EGFR内含内吞囊泡的平均囊泡pH（A和B），Endofin/HD-PTP的相互作用可以有效地溶酶体传递活化的EGFR，L15P-或C753S-内啡肽构建物，或（B）与mCherry质粒、WT-或T145K-HD-PTP（干扰HD-PTP与内啡肽的相互作用）构建物瞬时共转染的HD-PTP-depleted HeLa细胞。对表达mCherry的细胞进行单细胞FRIA分析（囊泡：n>190，显微镜视野：n>10）。绘制了EGFR追踪30分钟后内化EGFR的水泡pH分布。结果表明，NT、shEndofin、WT-Endofin、L15P-Endofen、C753S-Endofein、shHD-PTP-和T145K-HD-PTP-HeLa细胞中不同峰的平均囊泡pH值和囊泡数量。（C） BioID屏幕的点图显示与泛素化（Ub）和早期内体（EE）相关的蛋白质与WT-Endofin和C753S-Endofin非常接近。将标记生物素连接酶（BirA*）融合到WT-Endofin和C753S-Endofin的N末端，并用作诱饵。将构建物转染到Flp-In T-REx 293T细胞中。点图中的填充阴影表示平均光谱计数（Avg Spec），点的大小表示所有猎物的相对丰度，外圆颜色表示BFDR值。数据为n≥3个独立实验的平均值±SEM。未配对学生t检验：*p<0.05，*p<0.01，***p<0.001。
图5
图5
内皮素耗竭维持整合素α5和EGFR下游信号传导并增加细胞迁移（A）ZFYVE16型不同类型癌症患者的（内啡肽基因）。从cBioPortal数据库中提取数据并绘制为ZFYVE16型杂合性丢失。（B） 不同类型癌症患者内啡肽Z评分分析。从PRECOG数据库中提取并绘制每种癌症类型的Endofin Z评分。（C） Western印迹显示在纤连蛋白刺激（10μg/mL FN，7小时，37°C）后，与NT细胞相比，Endofin和HD PTP耗竭的HeLa细胞中整合素α5受体下游效应物FAK、Src和Erk1/2的磷酸化水平。eEF2螺栓用作加载控制。（D） 与NT细胞相比，用EGF（5 ng/mL，37°C）刺激内皮素和HD-PTP-depleted HeLa细胞0、15、30和60分钟。进行蛋白质印迹以揭示EGFR（左面板）及其下游效应物MEK（右面板）的磷酸化状态。eEF2螺栓用作加载控制。（E） 实时细胞分析（RTCA）测量内皮素和HD-PTP缺失HeLa细胞与NT细胞的细胞迁移。添加10%FBS的细胞培养基被用作化学引诱剂来触发细胞迁移。使用无血清培养基（不含化学引诱剂）作为阴性对照。使用整合素α5β1阻断抗体（10μg/mL）作为阴性对照，以抑制Endofin-depleted细胞中的细胞迁移。（F） 用非靶向（NT）shRNA或HD-PTP shRNA瞬时转染Endofin-depleted或对照HeLa细胞。通过Western blotting评估受体水平，并使用ImageJ软件通过密度分析进行量化。（G） 如（E）所示进行实时细胞分析，以比较瞬时转染HD-PTP shRNA或NT对照的Endofin-depleted细胞的迁移率。数据为n≥3个独立实验的平均值±SEM。未配对学生t检验：*p<0.05，*p<0.01，***p<0.001。
图6
图6
内皮素在受体转运中的作用示意图在内化受体靶向野生型细胞（WT）中的早期内体后，内皮素通过其FYVE域及其直接相互作用将HD-PTP招募到早期内体。内皮素通过STAM2与HD-PTP富含脯氨酸的区域结合，促进HD-PTP与早期内体上的ESCRT-0的相互作用。其次，内啡肽可能会经历变构构象修饰（可能通过翻译后修饰），从而削弱内啡肽/HD-PTP的关联并促进HD-PTP/CHMP4B的相互作用。最终，这导致EGFR向MVB和溶酶体降解的高效ESCRT依赖性排序。另一方面，在Endofin-depleted cells（shEndofin）中，HD-PTP与ESCRT-0的相互作用减少，这有利于受体再循环回质膜，并延迟ESCRT依赖的EGFR向MVB的分选和溶酶体降解。
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