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.2021年7月22日；22(15):7816.
doi:10.3390/ijms22157816。

缓慢释放和线粒体靶向硫化氢（H2S） 递送分子AP39诱导脑缺血耐受

巴托斯·波米尔尼 1, Weronika Krzyżanowska公司 1, 雅库布·朱奇克 1, Alicja Skórkowska公司 1, Beata Strach公司 2, 马戈扎塔·萨法尔兹 三, Katarzyna Przejczowska-Pomierny公司 三, 罗伯塔·托雷格罗萨 4, 马修·怀特曼 4, 莫妮卡·马尔金科夫斯卡 5, 乔安娜·佩拉 2, Bogusława Budziszewska公司 1
附属公司

缓慢释放和线粒体靶向硫化氢（H2S） 递送分子AP39诱导脑缺血耐受

巴托斯·波米尔尼等。 国际分子科学杂志. .

摘要

缺血性中风是世界上第三大死亡原因，约占全球总死亡人数的12%。尽管进行了数十年的研究，但现有的有效药物治疗仍然有限。一些证据表明硫化氢（H2S） 脑缺血动物模型和体外研究中的供体，如NaSH；然而，这些数据并不明确。本研究旨在验证AP39的神经保护活性，AP39是一种缓释线粒体靶向H2S传递分子。我们在缺血发作前7天给药AP39，并验证了诱导大脑对缺血耐受的潜力。为此，我们使用90分钟大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型，并使用LC-MS/MS、RT-PCR、LuminexTM（TM）测定绝对H2缺血24小时后，同侧额叶皮层、海马和背纹状体中的S水平、炎症标记物、神经营养因子信号通路和凋亡标记物。AP39（50 nmol/kg）降低了梗死体积、神经功能缺损和小胶质细胞标记物（Iba1）的表达。AP39还具有显著的抗炎活性，可减少脑缺血区Il-1β、Il-6和TNFα的释放。此外，AP39增强了神经营养因子BDNF-TrkB和NGF-TrkA的促生存途径，并降低了促凋亡proNGF-p75NTR公司-sortilin途径活性。这些变化与裂解半胱天冬酶3水平的降低相对应。总之，AP39治疗诱导了大脑内的适应性变化，从而发展了大脑对缺血的耐受性。

关键词：AP39；脑缺血；脑预适应；硫化氢；线粒体靶向；神经炎症。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。M.W.、R.T.和埃克塞特大学拥有与硫化氢递送分子及其治疗用途相关的知识产权（已授予和正在申请专利）。

数字

图1
图1
AP39对神经功能缺损和梗死体积的影响。(A类)由飞利浦量表确定的神经功能缺损，n个=8，Mann-Whitney检验**第页与MCAO相比<0.01。(B类)侵入体积，n个=6，学生的t吨-测试***第页与MCAO相比<0.001。(C类)脑切片TTC染色的代表性照片，用于确定梗死体积。数据表示为平均值±SEM(D类)在MCA闭塞（76%血流减少）和MCA、CCA再灌注期间分别记录的示例性血流图。大脑中动脉和颈总动脉。
图2
图2
MCAO和AP39对(A类——C类)自由H2S和(D类——F类)DTT发布H2S位于额叶皮层（CX）、海马（HIP）和背侧纹状体（DS），n个=8，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SD。
图3
图3
MCAO和AP39对额叶皮层（CX）和背纹状体（DS）促炎和抗炎细胞因子mRNA表达水平的影响。(A类,B类)CX和DS中的相对Il-1ßmRNA水平。(C类,D类)CX和DS中的相对Il-6 mRNA水平。(E类,F类)CX和DS中TNF-αmRNA的相对水平。(G公司,H（H）)CX和DS中的相对Il-10 mRNA水平。n个=8，单因素方差分析，然后对事后比较进行Sidak校正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
图4
图4
MCAO和AP39对额叶皮层（CX）和背侧纹状体（DS）促炎和抗炎细胞因子蛋白表达水平的影响。(A类,B类)CX和DS中的相对Il-1β水平。(C类,D类)CX和DS中的相对Il-6水平。(E类,F类)CX和DS中的相对TNFα水平。(G公司,H（H）)CX和DS中的相对Il-10水平。n个=8，单因素方差分析，然后是Sidak对事后比较的修正*第页<0.05和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
图5
图5
MCAO和AP39对Iba1蛋白表达水平的影响(A类)额叶皮层（CX）(B类)背纹状体（DS）和(C类)海马（HIP）。(D类)代表CX、HIP和DS的Iba1免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据以平均值±SEM表示。
图6
图6
MCAO和AP39对小鼠脑组织蛋白质表达的影响(A类——C类)CD86和(D类——F类)CD206在同侧大脑结构中的表达(A类,D类)额叶皮层（CX）(B类,E类)海马（HIP）和(C类,F类)背侧纹状体（DS）。(G公司)CD86和CD206的CX、HIP和DS的代表性免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页与MCAO或SHAM相比<0.05。数据以平均值±SEM表示。
图7
图7
MCAO和AP39治疗对神经营养因子mRNA和蛋白表达水平的影响。(A类——C类)BDNF在额叶皮层（CX）、海马（HIP）和背侧纹状体（DS）的相对mRNA表达水平。(D类——F类)CX、HIP和DS中NGF的相对mRNA表达水平。(G公司——我)BDNF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(J型——L（左）)proBDNF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(M（M）——O（运行）)NGF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(P（P）——R（右）)proNGF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(秒)代表CX、HIP和DS的BDNF、NGF、proBDNF和proNGF免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
图8
图8
MCAO和AP39对关键生长因子受体蛋白表达水平的影响。(A类——C类)TrkA在额叶皮层（CX）、海马（HIP）和背侧纹状体（DS）中的蛋白表达水平。(D类——F类)TrkB在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(G公司——我)p75的蛋白表达水平NTR公司分别在CX、HIP和DS中。(J型——L（左）)分别在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(M（M）)代表TrkA、TrkB、p75的CX、HIP和DS的免疫印迹NTR公司对于sortilin，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图表中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
图9
图9
MCAO和AP39对caspase 3裂解形式水平的影响(A类)在额叶皮层（CX）(B类)海马（HIP）和(C类)位于背侧纹状体（DS）。(D类)代表裂解半胱天冬酶3的CX、HIP和DS的免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页与MCAO或SHAM相比，<0.01。数据以平均值±SEM表示(E类)针对神经元标记物、微管相关蛋白2（MA2，绿色）和裂解半胱天冬酶3（Cas-3，红色）进行双重免疫染色的脑切片的代表性照片。染色切片用含DAPI的培养基进行细胞核染色（蓝色）。照片聚焦于运动皮层和背侧纹状体。由于SHAM和MCAO在荧光水平上没有明显变化，因此未显示海马的照片。比例尺=100µm。
图10
图10
硫化氢（H）分析2S） 在大鼠大脑结构中使用LC-MS/MS(A类)空白大鼠脑匀浆，加入800 nM浓度的SDB(B类)SHAM组大鼠海马匀浆计算H2S浓度=844 nM和(C类)SHAM组大鼠的相同海马匀浆经DTT-计算的H预处理2S浓度=2600 nM。SDB 1：米/z（z）=415/193和SDB 2：米/z（z）= 415/223.
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