国际分子科学杂志。2021年8月；22(15): 7816.
缓慢释放和线粒体靶向硫化氢（H2S） 递送分子AP39诱导脑缺血耐受
,1,* ,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,三 ,4 ,4 ,5 ,2和1
安娜·列纳爵士，学术编辑
收到日期：2021年6月30日；2021年7月16日接受。
摘要
缺血性中风是世界上第三大死亡原因，约占全球总死亡人数的12%。尽管进行了数十年的研究，但现有的有效药物治疗仍然有限。一些证据表明硫化氢（H2S） 脑缺血动物模型和体外研究中的供体，如NaSH；然而，这些数据并不明确。本研究旨在验证AP39的神经保护活性，AP39是一种缓释线粒体靶向H2S传递分子。我们在缺血发作前7天给药AP39，并验证了诱导大脑对缺血耐受的潜力。为此，我们使用90分钟大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型，并使用LC-MS/MS、RT-PCR、LuminexTM（TM）测定绝对H2缺血24小时后，同侧额叶皮层、海马和背纹状体中的S水平、炎症标记物、神经营养因子信号通路和凋亡标记物。AP39（50 nmol/kg）降低了梗死体积、神经功能缺损和小胶质细胞标记物（Iba1）的表达。AP39还具有显著的抗炎活性，可减少脑缺血区Il-1β、Il-6和TNFα的释放。此外，AP39增强了神经营养因子BDNF-TrkB和NGF-TrkA的促生存途径，并降低了促凋亡proNGF-p75NTR公司-sortilin途径活性。这些变化与裂解半胱天冬酶3水平的降低相对应。总之，AP39治疗诱导了大脑内部的适应性变化，从而发展了大脑对缺血的耐受性。
关键词：脑缺血、硫化氢、AP39、脑预处理、神经炎症、线粒体靶向
1.简介
中风是全世界成年人死亡和残疾的主要原因之一。每年有1500万例新的脑缺血病例，据估计，这是成年人长期残疾和永久残疾的最常见原因[1]. 不幸的是，没有有效的治疗方法适用于所有中风患者。静脉注射重组组织纤溶酶原激活剂（rt-PA）是唯一可用的药物治疗，但不能用于所有患者[2]. 由于对脑缺血和恢复血液供应后再灌注阶段的分子机制了解不足，阻碍了其他治疗程序的发展。因此，社会迫切需要制定新的药物治疗策略，使我们能够挽救许多生命。
直到最近，硫化氢（H2S） 被视为有毒气体。事实上，高剂量（50µM以上）的H2由于线粒体呼吸中细胞色素c氧化酶的抑制，S具有神经毒性作用。H（H）2S是一种小分子，与NO和CO一起被称为气体递质。这些分子在许多生理过程中起着重要作用[三,4]. 众所周知，H2S作为细胞内信使和神经调节剂[5]. H（H）2硫是在通常较低的浓度下内源性产生的，三种主要酶：胱硫醚-β-合成酶、胱硫苷-γ-裂解酶和3-甲基丙酮酸硫转移酶参与其合成[6,7]. 它是外周组织和大脑中细胞能量代谢的重要化合物[8]. H（H）2S信号在许多层面上作用于线粒体，影响线粒体呼吸以及线粒体控制的凋亡。H（H）2S以浓度依赖的方式调节线粒体电子传递链的活性。当前的教条指出，在低浓度下，H2S通过硫醌氧化还原酶（SQOR，在中枢神经系统中低表达；CNS）自身的不可逆氧化作用，作为电子传输链的电子供体。从H获得的电子2S氧化通过络合物III进入电子传递链。这种活性加强氧化磷酸化和ATP合成[9,10,11]. 因此，增强H2S代谢可能在缺血或缺氧和缺糖期间保护线粒体。另一方面，H2S在50µM以上的高浓度下抑制电子传递链，导致氧化还原失衡、细胞增殖抑制和代谢向还原羧基化转变[12].
目前的证据表明H2S在中枢神经系统信号传导中发挥重要作用，充当细胞内信使和神经调节剂[5]. 通过使用H2硫生成化合物，如NaSH、H2S已被证明调节NMDA受体并上调GABA-B受体[13,14]. 数据显示H2S保护神经元免受氧化应激，表现出与大脑中最有效的抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）相似的特性，更重要的是，它刺激GSH的产生[15,16]. 已经证明H2S通过直接作用于产生活性氧的线粒体，抑制氧化应激，清除活性氧（ROS）[17,18]. H（H）2S提高星形胶质细胞和小胶质细胞内的钙水平，从而调节其活性。已经证明H2S通过减少促炎细胞因子的释放和增加抗炎细胞因子的水平而具有抗炎作用[19,20,21]. H的这种影响2S也出现在神经系统疾病中，包括阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病[22,23]，表明H2生成硫的化合物可以有效地抵消这些有害影响。H的病理生理作用2S已被研究用于各种疾病，包括心血管疾病和血液病，但首先是神经系统疾病。然而，H的作用2S在脑缺血中的表达尚不清楚。有来自动物和体外研究的数据证实了无机H的神经保护作用2S供体，缺血/再灌注（I/R）或氧葡萄糖剥夺（OGD）模型中的NaSH[24,25]. 相对低剂量的H2S供体，主要是NaSH（即静脉注射25-µmol/kg体重），在脑缺血后和缺氧动物模型中发挥神经保护作用[26,27,28,29]. 在缺血发作30分钟后给动物注射NaSH（剂量为0.2和0.4µmol/kg），具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[30]. 大脑中动脉闭塞（MCAO）60分钟开始时给予NaSH（60µmol/kg剂量），除了减少血脑屏障损伤外，还显著减小了梗死面积[31]. H（H）2作为预处理策略的S供体也显示出在视网膜、肝脏或肠的I/R损伤中的有益作用，但没有关于诱导大脑对缺血耐受的数据[32,33,34,35,36]. 另一方面，有报道显示H的神经毒性作用2S供者或H的改善作用2合成H的酶的S清除剂或抑制剂2体内S[37,38]. 无机硫化物盐（Na2S和NaSH）主要用于研究H2S对脑缺血的影响。然而，人们非常关注无机H2S供体产生H2S在高浓度下瞬间释放，因此可能引起神经毒性效应。生成的H的神经保护活性2S具有剂量依赖性，使用稳定的H时，只有相对较低的浓度低于50µM2S供体，可能在缺血后产生所需的保护。因此，无机化合物是氢的不可靠来源2S和可能导致对所得结果的误解[16].
其中一个有希望的化合物是AP39，它是一种新的、稳定的、以线粒体为靶向的H2S捐赠者。AP39[（10-oxo-10-（4-（3-硫氧基-3H-1,2-二硫醇-5yl）苯氧基）癸基）三苯基溴化鏻]由线粒体靶向基序三苯基鏻（TPP+）组成，与H2脂肪族连接剂的S-供体部分（二硫醚）[39]. 由于这种化学结构，AP39释放H2这些细胞器在脑缺血后发生的功能障碍可能是病理事件的第一步，这些病理事件导致细胞能量失衡、氧化应激、神经炎症，并最终引发各种细胞死亡机制。在时空上，这些过程与H的减少相关2脑组织中的S水平和脑缺血后这种气体神经递质的稳态被破坏[29].
本研究分析了AP39的潜在神经保护作用。本研究旨在确定线粒体H2S诱导大脑的适应性变化，从而诱导大脑对缺血的耐受性。这种现象被称为大脑预适应，包括诱导大脑对强损伤性刺激（如缺血）的耐受。低强度的潜在损伤性刺激，如短期缺血或亚毒性剂量的3-硝基丙酸（3NP），会对大脑产生此类影响[40]. 自H起2S、 与3NP类似，在有毒浓度下，低剂量的H会破坏线粒体呼吸链2S供体AP39与3NP同样可能作为脑预适应介质。在本研究中，动物暴露于七种低浓度剂量的AP39，最后一次给药后3天，对动物进行90分钟MCAO或SHAM的手术。这种剂量方案用于预处理策略中，以诱导分子适应性变化，从而协调脑缺血耐受机制[41,42,43]. 三天的延迟时间是为了排除最后一次给药的可能影响。再灌注后24小时，评估神经功能缺损；接下来，处死动物，分析获得的组织的梗死体积以及游离和束缚H水平2此外，还研究了治疗对神经炎症过程、神经营养因子水平及其信号通路和细胞凋亡标志物的影响。在进行的分析中，分析了同侧的三个大脑结构：背纹状体、额叶皮层和海马。这些大脑结构代表或多或少受到脑缺血影响的区域[44,45,46].
2.结果
2.1. AP39治疗降低了神经功能缺损和梗死体积
90分钟MCAO程序在再灌注24小时后导致严重梗死。MCAO组神经功能缺损的平均得分为7.097±2.495。相比之下，AP39组的神经功能缺损评分显著降低（2.042±2.074；第页=0.0005）再灌注后24小时(A） ●●●●。TTC染色程序显示，与MCAO组相比，AP39治疗7天可使梗死体积减少74.6%（38.65±2.898 mm）三MCAO vs.9.815±3.444毫米三7xAP39 MCAO，第页< 0.0001). SHAM操作的动物在神经功能缺损和梗死方面没有表现出任何显著变化(B、 C）。
AP39对神经功能缺损和梗死体积的影响。(A类)由飞利浦量表确定的神经功能缺损，n个=8，Mann-Whitney检验**第页与MCAO相比<0.01。(B类)侵入体积，n个=6，学生的t吨-测试***第页与MCAO相比<0.001。(C类)脑切片TTC染色的代表性照片，用于确定梗死体积。数据表示为平均值±SEM(D类)在MCA闭塞（76%血流减少）和MCA、CCA再灌注期间分别记录的示例性血流图。大脑中动脉和颈总动脉。
2.2. AP39防止MCAO导致游离和DTT-可释放H的消耗2S级
MCAO显著降低游离H水平2与SHAM动物相比，S在背侧纹状体中的含量增加了54.42%，而在额叶皮层或海马中没有这种影响。在MCAO动物中，AP39治疗显著提高了游离H2S在额叶皮层和背侧纹状体中的表达分别为26.36%和70.47%(第页=0.0431和第页=0.001），与MCAO动物相比().
MCAO和AP39对(A类–C类)自由H2S和(D类–F类)DTT发布H2S位于额叶皮层（CX）、海马（HIP）和背侧纹状体（DS），n个=8，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SD。
由于有人提出H2S在体内以自由形式存在，但也以可逆结合形式存在，如硫化物、多硫化物和过硫化物，我们通过DTT消化组织匀浆间接量化了这些形式。因此，我们测定了释放H的浓度2有趣的是，在MCAO组（与SHAM组相比），我们观察到释放的H显著减少2S仅在海马中表达（增加53.14%，第页=0.0001），对其他大脑结构没有显著影响。在7xAP39 MCAO组中，额叶皮层和海马以及背侧纹状体显著增加（分别增加118.95%、48.81%和155.01%，第页< 0.0001,第页=0.045和第页分别为0.0002）。将接受SHAM程序的AP39治疗的实验组与经溶媒预处理的SHAM动物相比，释放的H显著增加2在额叶皮层观察到S（185.6%，第页<0.0001），但不在其他大脑结构中().
2.3。AP39减轻MCAO后的神经炎症
Il-1ß、Il-6和TNFα是参与神经炎症发生和发展的促炎细胞因子。这一过程是脑缺血自然过程中损伤形成的标志之一[47]. Il-10是一种抗炎细胞因子，已知可促进神经保护并减轻脑缺血后神经炎症的细胞毒性作用[48]. 使用Luminex测量Il-1ß、Il-6、Il-10和TNFα的水平以及编码这些细胞因子的mRNATM（TM）RT-qPCR技术。神经炎症过程主要由小胶质细胞调控，特别是小胶质细胞对细胞毒性M1样细胞和细胞保护性M2样细胞的激活和极化。为了评估这些过程，使用免疫印迹法测定小胶质细胞标记物（Iba1）、M1样小胶质细胞表型标记物（CD86）和M2样小神经胶质细胞表型标志物（CD206）的表达水平。
采用RT-qPCR检测编码Il-1ß、Il-6、Il-10和TNF-α的特异mRNA的表达水平。MCAO导致额叶皮层和背侧纹状体中Il-1ß、Il-6和TNFαmRNA显著增加(). 比较MCAO和7xAP39 MCAO发现，这些治疗显著降低了额叶皮层和背纹状体中促炎细胞因子的mRNA表达水平。MCAO后，额叶皮层中Il-10的mRNA表达水平显著升高，而背侧纹状体中则没有。AP39治疗导致两个实验组背侧纹状体中Il-10 mRNA表达显著增加：7xAP39 SHAM（vs.SHAM，第页=0.0059）和7xAP39 MCAO（与MCAO相比，第页=0.0012）；然而，它并没有在额叶皮层引起这种效应(). 缺血和AP39治疗均未引起海马体的任何变化（数据未显示）。
MCAO和AP39对额叶皮层（CX）和背纹状体（DS）促炎和抗炎细胞因子mRNA表达水平的影响。(A类,B类)CX和DS中的相对Il-1ßmRNA水平。(C类,D类)CX和DS中的相对Il-6 mRNA水平。(电子,F类)CX和DS中TNF-αmRNA的相对水平。(克,H（H）)CX和DS中的相对Il-10 mRNA水平。n个=8，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据以平均值±SEM表示。
MCAO导致额叶皮质和背侧纹状体的促炎细胞因子水平显著升高，如Il-1ß、Il-6和TNFα。在接受AP39和MCAO（7xAP39 MCAO）的动物中，与MCAO组相比，观察到Il-1、Il-6和TNF-α显著降低。AP39增加了两个实验组7xAP39 SHAM（与SHAM相比，第页=0.0355）和7xAP39 MCAO（相对于MCAO，第页=0.037）；然而，在额叶皮层没有观察到这种效应(). 海马体各组之间的这些参数没有变化（数据未显示）。
MCAO和AP39对额叶皮层（CX）和背侧纹状体（DS）促炎和抗炎细胞因子蛋白表达水平的影响。(A类,B类)CX和DS中的相对Il-1β水平。(C类,D类)CX和DS中的相对Il-6水平。(电子,F类)CX和DS中的相对TNFα水平。(克,H（H）)CX和DS中的相对Il-10水平。n个=8，单因素方差分析，然后是Sidak对事后比较的修正*第页<0.05和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
缺血显著增加大脑皮层和背侧纹状体中Iba1的表达(第页=0.032和第页=0.0017），而AP39治疗降低了接受SHAM或MCAO程序的两个实验组的额叶皮质Iba1水平(第页=0.013和第页分别=0.0005）(). 在接受AP39治疗和MCAO治疗的动物的背纹状体中，观察到Iba1的表达显著降低(第页= 0.0002). 海马体中的Iba1表达没有显著变化。MCAO程序没有引起CD86表达的任何显著变化；然而，在接受AP39治疗和缺血的组中，在额叶皮层和背侧纹状体中观察到CD86的表达减少(第页=0.048和第页分别=0.016）(). 缺血和AP39治疗对分析的大脑结构中CD206的表达水平没有任何影响。
MCAO和AP39对Iba1蛋白表达水平的影响(A类)额叶皮层（CX）(B类)背纹状体（DS）和(C类)海马（HIP）。(D类)代表CX、HIP和DS的Iba1免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，然后对事后比较进行Sidak校正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
MCAO和AP39对巨噬细胞蛋白表达的影响(A类–C类)CD86和(D类–F类)CD206在同侧大脑结构中的表达(A类,D类)额叶皮层（CX）(B类,电子)海马（HIP）和(C类,F类)背侧纹状体（DS）。(克)CD86和CD206的CX、HIP和DS的代表性免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页与MCAO或SHAM相比<0.05。数据表示为平均值±SEM。
2.4。AP39调节神经营养因子及其受体的表达
实验程序和治疗均未导致Bdnf公司分析大脑结构中的mRNA表达。MCAO提出Ngf公司背侧纹状体的表达水平(第页= 0.038). AP39治疗提高了Ngf公司局灶性脑缺血动物海马和背纹状体的表达(第页= 0.047,第页分别为0.015）。在SHAM手术动物的海马中，AP39治疗显著升高Ngf公司(第页= 0.0015) ().
MCAO和AP39治疗对神经营养因子mRNA和蛋白表达水平的影响。(A类–C类)BDNF在额叶皮层（CX）、海马（HIP）和背侧纹状体（DS）的相对mRNA表达水平。(D类–F类)CX、HIP和DS中NGF的相对mRNA表达水平。(克–我)BDNF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(J型–L（左）)proBDNF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(M（M）–O（运行）)NGF在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(P（P）–R（右）)促NGF的蛋白表达水平分别在CX、HIP和DS中。(秒)代表CX、HIP和DS的BDNF、NGF、proBDNF和proNGF免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比，<0.001。数据表示为平均值±SEM。
MCAO程序提高海马NGF水平(第页=0.048）和背纹状体(第页=0.0023），但在额叶皮层没有这种影响。仅在海马中观察到AP39治疗对NGF水平的影响，在SHAM和MCAO受试动物中，AP39治疗组大鼠的NGF显著高于其各自的对照组(第页=0.0002和第页分别=0.018）。I/R不影响proNGF在任何脑结构中的表达，但AP39治疗导致SHAM和MCAO组海马中proNGF水平降低(第页=0.026和第页分别=0.0009）。MCAO导致额叶皮层BDNF蛋白水平降低，但海马或背纹状体BDNF蛋白质水平没有降低，而AP39治疗显著提高了7xAP39 SHAM动物额叶皮层的BDNF浓度(第页=0.025）和7xAP39 MCAO动物的背纹状体(第页= 0.015). 只有在海马中观察到前BDNF水平的变化，在海马中MCAO程序增强了其表达(第页=0.01），但AP39治疗阻止了这种上升(第页= 0.009) ().
MCAO程序没有改变受检大脑结构中TrkA的表达，但AP39治疗显著提高了缺血动物额叶皮质中TrkA的表达(第页=0.044），并且在SHAM和MCAO实验组的海马中(第页=0.0485和第页=0.0017）和背纹状体(第页< 0.0001). 在额叶皮层和背侧纹状体，I/R导致TrkB的表达显著降低(第页=0.039（对于额叶皮层）(第页=0.007（背侧纹状体），但海马区无明显变化。在接受AP39治疗的MCAO动物中，TrkB在额叶皮层和背侧纹状体中的表达升高。MCAO程序导致p75显著降低NTR公司仅在背侧纹状体(第页=0.027），然而，在遭受缺血并用H治疗的动物中2S供体，额叶皮质中该受体的表达减少(第页= 0.041). MCAO降低背侧纹状体中sortilin的表达(第页=0.039），而AP39治疗降低了缺血动物额叶皮层和海马中sortilin的表达(第页=0.049和第页=0.016）().
MCAO和AP39对关键生长因子受体蛋白表达水平的影响。(A类–C类)TrkA在额叶皮层（CX）、海马（HIP）和背侧纹状体（DS）中的蛋白表达水平。(D类–F类)TrkB分别在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(克–我)p75的蛋白表达水平NTR公司分别在CX、HIP和DS中。(J型–L（左）)分别在CX、HIP和DS中的蛋白表达水平。(M（M）)代表TrkA、TrkB、p75的CX、HIP和DS的免疫印迹NTR公司对于sortilin，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页<0.01和***第页与MCAO或SHAM相比<0.001。数据表示为平均值±SEM。
2.5. AP39缓解MCAO诱导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3激活
采用免疫印迹法和脑切片双染色免疫荧光法分析caspase 3的活性形式。在免疫印迹分析中，MCAO导致额叶皮质裂解caspase 3表达显著升高(第页=0.031）和背纹状体(第页= 0.0048) (). 在用AP39预处理的实验组中，观察到I/R模型动物的背纹状体和海马显著减少(第页=0.016和第页分别=0.018）。在经AP39预处理的SHAM手术动物中，仅在海马中观察到裂解caspase 3的减少(第页= 0.044). 裂解半胱天冬酶3的免疫荧光染色显示，AP39局部降低了局灶性脑缺血动物额叶皮层和背侧纹状体神经元中活性半胱天蛋白酶3的水平().
MCAO和AP39对caspase 3裂解形式水平的影响(A类)在额叶皮层（CX）中(B类)海马（HIP）和(C类)位于背侧纹状体（DS）。(D类)代表裂解半胱天冬酶3的CX、HIP和DS的免疫印迹，以及通过无染色技术显示的总蛋白量。样本的顺序与图中的顺序相同。n个=6，单因素方差分析，随后是Sidak对事后比较的修正*第页< 0.05, **第页与MCAO或SHAM相比<0.01。数据表示为平均值±SEM(电子)针对神经元标记物、微管相关蛋白2（MA2，绿色）和裂解半胱天冬酶3（Cas-3，红色）进行双重免疫染色的脑切片的代表性照片。染色切片用含DAPI的培养基进行细胞核染色（蓝色）。照片聚焦于运动皮层和背侧纹状体。海马体的照片没有显示，因为SHAM和MCAO在荧光水平上没有明显的变化。比例尺=100µm。
3.讨论
给药AP39（50 nmol/kg）表明，该化合物具有神经保护活性，在接受AP39治疗和MCAO治疗的实验组中，梗死体积和神经功能缺损显著减少。这些表明线粒体H2S可能会引起脑组织的一些适应性变化。背侧纹状体是MCAO后受损最严重的脑区[49]，游离H的浓度2I/R后24小时S显著降低()，这与其他报告一致[29]. AP39保持了游离H水平2S在基础水平但增加了H的结合形式2S（即过硫化物或多硫化物），通常称为生理可用H2S.AP39增加了H的束缚和可用池2S也存在于额叶皮层和海马体中，并显著减少梗死体积和神经功能缺损(). 众所周知，线粒体代谢硫化物进行呼吸[8]，由于AP39提供H2线粒体中的S[39,50]，观察到的神经保护可能来自H的分解代谢增加2S by SQOR，通过辅酶Q向线粒体链复合物III提供电子，提高ATP的生成并挽救线粒体膜电位[9,11,51,52]. H（H）2S介导的蛋白质组过硫化可能改变特定蛋白质的功能；因此，过硫化模式和结合氢水平的增加2S可能是H的潜在机制2S-介导的脑预处理。事实上，AP39以前已经被证明过硫化线粒体蛋白质[53,54]. 这一理论可能得到最近发现的支持，其中蛋白质组通过H2S主要参与糖酵解和克雷布斯循环等初级代谢途径[55]. 这些途径整合了关键的反应，维持了细胞内称为体内平衡的能量平衡，这种平衡在缺血发作后即被破坏。过硫反应可能改变关键蛋白质的功能或增强氧化磷酸化，它依赖于SQOR；然而，这种酶在大脑中的表达/活性很低[56]. 最近的数据表明，H2吸入硫诱导脑缺血耐受及预处理机制依赖于SQOR的上调[8]. 然而，要验证这种效应在缓释靶向化合物AP39的作用机制中是否也至关重要，还需要进一步和更详细的研究。
脑缺血后，小胶质细胞和星形胶质细胞在数小时内被激活。这导致产生大量促炎细胞因子和趋化因子。这会引发急性神经炎症，进而导致脑细胞进一步受损。激活的小胶质细胞在缺血性卒中中的功能尚不完全清楚，其不同的作用可能是由于小胶质细胞表型不同所致。在我们当前的研究中，I/R导致额叶皮层和背侧纹状体这两个易梗死脑区的小胶质细胞激活，通过Iba1表达进行测量。AP39治疗逆转了这种效应，确保了Iba1在基础水平的表达。在用AP39处理并经历缺血的动物的额叶皮层和背侧纹状体中，我们观察到CD86的表达减少，CD86是小胶质细胞的细胞毒性M1样表型的标志物。这可能表明AP39降低了小胶质细胞向细胞毒性M1样表型的极化，但另一方面，我们没有注意到任何实验组中CD206（小胶质细胞神经保护M2样表型标记）表达水平升高。M1样小胶质细胞分泌促炎细胞因子，如TNFα、Il-1β、Il-12、Il-23和一氧化氮（NO）；因此，它们会加剧炎症和组织损伤。相反，M2样小胶质细胞分泌抗炎细胞因子（TGF-β、IL-4、IL-10和IL-13），这些细胞抑制炎症并促进组织恢复[57,58]. 在本研究中，小胶质细胞激活结果与促炎细胞因子水平的数据一致。AP39显著降低了Il-1β、Il-6和TNFα的mRNA和蛋白水平，这在MCAO后通常会升高。在脑预处理的其他参考策略中，如通过缺血预处理、3NP预处理或远程预处理，也观察到了类似的效果[59,60]. AP39治疗降低了急性神经炎症的细胞毒性介质：Il-1β、Il-6和TNFα（mRNA和蛋白）的水平，但也调节了生存因子Il-10的释放。在背侧层，脑结构主要受I/R影响，两组MCAO和SHAM患者经AP39治疗后，Il-10的mRNA和蛋白水平均显著升高。这可能表明H2缺血前给药的S供体诱导了一些适应性变化，因此增加了抗炎症Il-10的释放，后者通过激活JAK1-STAT3信号通路介导其神经保护作用[61,62]. 缺血发作后，激活胶质细胞的主要机制之一依赖于死亡神经元释放的分子[63,64]. 另一方面，增强的H2AP39治疗后可能发生的S分解代谢可促进神经元存活，从而间接减少胶质细胞的活化。有数据表明H2S能够通过抑制p38-MAPK信号通路直接沉默小胶质细胞的激活[65]. 然而，神经保护是由于AP39对这些细胞的直接影响导致小胶质细胞活化减少所致，还是由于AP39代谢增强的神经元死亡减少所致，或者两者都参与，尚不清楚，这一问题需要进一步详细的研究。
神经营养素如BDNF或NGF被认为是神经元和突触可塑性的介质。在我们的研究中，I/R降低了背侧纹状体的BDNF信号通路，其中TrkB、sortilin和p75的表达NTR公司受体减少；然而，BDNF（蛋白和mRNA）水平没有变化，而前BDNF仅在海马区上调。由于在MCAO模型中，背侧纹状体是缺血的核心，在那里形成了具有增强蛋白水解活性的广泛坏死损伤，因此观察到的变化可能是由于细胞丢失所致。AP39治疗显著提高了额叶皮层和背侧纹状体TrkB受体的表达，降低了p75的表达NTR公司额叶皮层的受体和海马sortilin的表达降低。BDNF通过TrkB发挥作用，促进细胞存活和突触可塑性。通过与p75相互作用，使proBDNF不成熟NTR公司受体和辅助受体sortilin，促进细胞死亡和突触降解[66,67,68]. 因此，尽管BDNF（蛋白质和mRNA）水平没有显著差异，但BDNF-TrkB通路的神经保护活性似乎增强，促凋亡作用依赖于p75的信号传导NTR公司-在AP39处理的大鼠中，sortilin可能减少。以类似的方式，H2据报道，S供体NaSH在体外研究中显示出神经保护活性[69]; 然而，据我们所知，在中风动物模型中还没有关于这种机制的体内数据。
就NGF而言，所得结果表明中风本身触发了与该因子作用相关的内源性保护机制。额叶皮层和背侧纹状体中NGF mRNA水平的增加和背侧纹状体内NGF蛋白的上调，而TrkA水平没有变化，这表明脑卒中增强了NGF-TrkA保护性信号通路。反过来，p75NTR受体及其辅受体sortilin水平降低，即使proNGF没有变化，也意味着proNGF的细胞毒作用可能会略有降低。
AP39对海马的保护作用最强，两个实验组（7xAP39 SHAM和7xAP39-MCAO）的NGF（mRNA和蛋白）表达升高，proNGF表达降低。此外，AP39显著增加了两个实验组海马和背侧纹状体中TrkA的表达，而在额叶皮层中，仅在缺血动物中观察到TrkA升高。Sortilin在用AP39处理并受到缺血的动物的海马中被下调。NGF通过激活TrkA受体促进细胞存活和突触可塑性[70,71]. 类似于proBDNF，proNGF，通过与p75相互作用NTR公司受体，促进细胞死亡和突触降解[66,67,68]. Sortilin被认为是促NGF诱导的神经元细胞死亡所必需的重要辅助受体[72]. BDNF和NGF刺激树突和轴突的生长，形成新的突触连接[73,74]. 因此，神经营养素在脑组织卒中后恢复中起着至关重要的作用，尤其是在梗死周围区域，那里的神经通路被缺血核心物理性中断。在这项研究中，AP39增强了这两种因子的神经营养信号传导，减少了原形式的相反作用。AP39治疗后观察到的脑缺血耐受性表明2S供体可能通过增强神经营养因子的信号通路来揭示其作用。然而，这需要进一步详细的研究。
在我们的研究中，MCAO增加了额叶皮层和背侧纹状体中裂解caspase 3的表达，提示细胞凋亡的诱导。然而，AP39降低了实验组海马和局灶性脑缺血动物背侧纹状体中caspase 3的表达。在免疫印迹和脑切片的免疫荧光染色中均观察到这些变化。背侧纹状体和局部额叶皮层都是MCAO后24小时严重受损的大脑结构[75]. MCAO在缺血后24小时没有增加海马caspase 3的激活；然而，caspase3是细胞凋亡的执行酶，被认为是细胞死亡的延迟调节机制。海马CA1层的颗粒细胞最容易受到损伤；然而，在皮层或背侧纹状体观察到这种变化后数天，该细胞群的凋亡降解达到峰值[46,76]. 在AP39治疗的动物中，背侧纹状体caspase 3激活的减少可能与游离H的安全浓度有关2S和束缚H的升高水平2S.H氧化增加2S增强线粒体内呼吸链的功能。H的分解代谢增加2S不仅是ATP的来源，还提供线粒体膜电位，阻止细胞色素c介导的细胞凋亡的启动。此外，在缺血组和AP39预处理组的海马中，caspase 3激活的下调可能是由于NGF-TrkA信号增强引起的，这与其他数据一致，表明NGF在中风期间的保护作用[70,71].
谨慎地指出本研究的局限性。虽然我们的研究明确表明AP39（50 nmol/kg）可以防止MCAO中风期间大脑中的有害信号传导和随后的脑损伤，但我们仅评估了一种剂量的AP39和一种给药途径。口服途径在临床上是最可行的，尽管在急性情况下，静脉给药是必要的。然而，AP39的ADME/PK特性尚不清楚，需要进行大量工作来优化剂量反应、配方和给药。我们目前的研究没有显示出剂量反应，这需要在未来的研究中加以研究。同样，我们是预防性给药（即在MCAO之前），而不是治疗性给药。虽然卒中预防性治疗有相当大的优点，但未来的研究需要治疗剂量（即MCAO后）。这项研究的另一个局限性是，我们只使用雄性大鼠，而雄性和雌性的中风方面可能不同。由于发情周期监测的必要性，对雌性动物的研究更具挑战性，这大大增加了每个实验组的动物数量。发情周期对中风结局有直接影响。然而，这是首次研究AP39在脑缺血中可能的有益作用。我们的目的是提供数据，以便与其他疾病模型进行比较，例如心肌梗死或急性肺损伤研究，实验中使用雄性大鼠。总之，在进行大规模研究之前，需要对AP39等化合物进行两性检测，以证明其原理。最近的数据表明，用H预处理2S显著增加H的分解代谢2S到SQOR，刺激线粒体功能[8]. 这表明，在缺血发作前反复给予AP39可能同样增强SQOR的表达，从而可能提高结合H的水平2S，从而增强线粒体的功能并拯救缺血区的神经元。此外，修饰过硫蛋白可能会改变其功能，但尚不清楚哪些蛋白质因H而过硫2S分解代谢。众所周知，AP39增加复合物II和III的活性，并增加过硫化；然而，遗憾的是，这项研究并没有解释脑缺血模型中这些紧迫的问题[11,54]. 因此，为了证实这一突破性机制，有必要对线粒体代谢以及全球蛋白质过硫化模式进行更详细的研究。我们目前正在确定其他参数，以确认作用机制，例如对细胞生物能量学的治疗效果和治疗后的过硫分析。
4.材料和方法
4.1. 动物与实验设计
所有实验均在雄性Sprague-Dawley大鼠（280-320克，Charles Rivers）上进行。这些动物被维持在22±2°C的正常昼夜循环，可以自由获取食物和水。所有实验方案均符合国家卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》，并于2017年1月19日经波兰科学院药理研究所第二地方伦理委员会批准（项目识别码：11/2017）。所有涉及动物的研究都是根据ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南报告的，包括在实验的每个点让研究人员对动物的身份盲视的程序。
4.2. 动物治疗
将动物随机分为以下组：SHAM、MCAO、7xAP39 SHAM和7xAP39MCAO。对于每个组，n个=6-8只动物。在7xAP39 SHAM和7xAP39-MCAO组中，在诱导缺血前72小时用AP39（50-nmol/kg体重，静脉注射）进行7天的最后剂量治疗。再灌注开始到动物断头和组织收集之间的时间间隔为24小时。AP39溶解在PBS中的1%二甲基亚砜溶液中。在对照组MCAO和SHAM中，与AP39预处理组相同的注射方案中给药PBS中1%二甲基亚砜溶液。AP39的合成如我们之前所述[39].
4.3. 局灶性脑缺血模型
根据Longa等人的方法诱导MCAO，以诱导如前所述的短暂局灶性脑缺血[42,43,77]. 所有手术都是在立体显微镜下进行的（徕卡，A60F，Wetzlar，德国），并使用加热毯（恒温毯系统；哈佛仪器）将体温维持在生理水平。使用血液流量计（PeriFlux System 6000，Perimed，Jakobsberg，Sweden）确认动脉闭塞，血流减少70%（或更高）表示手术成功。用5%异氟烷麻醉大鼠进行诱导，2.5%异氟烷麻醉维持。暴露左侧颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）和颈总动脉（CCA）后，ECA的所有分支均被凝固，动脉被固定。ICA和CCA暂时用微血管夹固定。将硅涂层灯丝（Doccol，Sharon，MA，USA）引入ECA的管腔，并将其推进，直到血流减少。将夹子从CCA上取下，用0.2%罗哌卡因（阿斯利康，威德，德国）局部麻醉后，用丝线固定伤口。保持闭塞90分钟。然后，重新打开伤口，取出丝状物以恢复血流。伤口用缝线缝合。SHAM操作按上述方式进行，未插入灯丝。手术后24小时，对每只动物的神经功能缺损进行评估，然后处死动物，并适当解剖脑组织进行分析。
4.4. 神经系统缺陷
再灌注24小时后评估神经功能缺损。正如我们之前所描述的，使用了Philips等人2000年的10分评分系统[78]. 简言之：在MCAO后1小时和24小时对动物进行评估。对以下神经症状进行评估和评分：当动物向对侧推时未表现出任何阻力时，得4分；当动物朝对侧旋转时，得3分；如果动物表现出对侧肩内收，如果观察到对侧前肢屈曲，则加2分，加1分。0分表示没有神经系统缺陷，而10分是最大的神经系统缺陷。
4.5. TTC染色——梗死体积的测量
为了确定梗死体积，准备了单独的实验组（每组，n个= 6). MCAO后24小时，动物被斩首，他们的大脑立即被切除，并使用大脑矩阵进行切片（美国马萨诸塞州霍利斯顿市哈佛仪器公司）。用1%的2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）染料溶液（美国密苏里州圣路易斯市西格玛-奥尔德里奇）在37°C的0.01-M磷酸盐缓冲盐水（西格玛-Aldrich，密苏里洲圣路易斯，美国）中在黑暗中对冠状切片（2 mm厚）进行染色10分钟。然后，将切片固定在10%磷酸盐缓冲福尔马林（西格玛-Aldrick，圣路易斯）中。Louis，MO，USA）在4°C下保持30分钟。被染色和固定的大脑切片是由一名不知道受试者身份的研究人员使用配备照相机的手术显微镜（德国莫蒂克市莫蒂坎）拍摄的。梗死体积由同一研究人员通过NIH ImageJ软件（美国国立卫生研究院，8.0版）确定。梗死体积计算为每个轮廓白色区域乘以大脑切片厚度的总和，单位为mm三.
4.6条。Luminex分析
手术后24小时，将大脑从颅骨中取出，立即将同侧大脑半球从额叶皮层、海马和背侧纹状体的冰上切开，然后储存在−80°C下。接下来，称量冷冻组织，10%(w个/v（v）)使用IKA-ULTRA-TURRAX T8均质器在pH 7.4的0.01-M磷酸盐缓冲液中均质制备匀浆。以10000×克，并使用市售Milliplex分析上清液中的Il-1β、Il-6、Il-10和TNFα水平TM（TM）MAP工具包（Millipore，Billerica，MA，USA），根据制造商的协议。简单地说，匀浆与靶向特异性抗体固定化磁珠的混合物在密封的96 well微孔板上在室温下孵育2小时，并在摇床上搅拌。接下来，使用手持式磁铁，使用提供的清洗缓冲液清洗磁珠三次。添加检测抗体，并在RT下搅拌密封板培养1小时。接下来，将链霉亲和素-藻红蛋白溶液供应到每个孔中，包含标准品、质量控制和样品（一式三份），并在RT下搅拌培养板30分钟。然后，使用手持式磁铁，将平板清洗三次，在轻轻去除微孔内容物后，添加DriveFluid，并将磁珠重新悬浮在平板振动筛上5分钟。使用带有xPONENT软件的MAGPIX Luminex分析仪（Luminex Corporation，Austin，TX，USA）进行定量分析。使用样条曲线填充法根据标准曲线计算分析物水平，并以匀浆pg/mL表示。
4.7. 西部印记
将额叶皮层、海马和背侧纹状体的组织在含有1-mM PMSF、1-mM Na的2%SDS中匀浆2VO（旁白）4使用Ultra-Turrax和超声波均质器，20-mM NaF和磷酸酶蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）。在95°C下变性10分钟后，通过10000×克在4°C下保持10分钟。使用BCA蛋白质检测试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默科学公司）测定上清液中的蛋白质浓度。设置适当的蛋白质浓度后，将溶液与负载缓冲液（含10%2-巯基乙醇）以1:1的比例混合，并在95°C下加热10 min。样品以总蛋白浓度为30µg/10µL的8–16%SDS聚丙烯酰胺凝胶（Criterion，TGX-无染色凝胶，Bio-Rad，Hercules，CA，USA）梯度加载，并进行电泳（200 V，45 min）。接下来，将蛋白质半干燥并转移到PVDF膜上（TurboBlot，Bio-Rad），并在5%的白蛋白溶液中封闭。将膜与适当浓度的初级抗体在4°C下孵育过夜(). 过夜培养后，在TBST中清洗膜，然后在1%白蛋白溶液中清洗，并在室温下与各自的二级抗体在1%白蛋白液中与过氧化物酶结合培养1小时。清洗后，这些膜是使用ECL方法开发的（即，美国加利福尼亚州圣何塞市Advansta公司的Western Bright Quantum）。使用G-Box成像系统（Syngene，Frederick，MD，USA）对膜的化学发光进行成像，并使用基因工具软件（Syngen，Frederick，MD和USA）分析蛋白质表达，并相对于样品中的总蛋白质含量进行表达。
表1
蛋白质印迹和荧光显微镜技术中使用的一级和二级抗体列表。
| 抗体 | 制造商 | 目录编号 | 使用的稀释 |
|---|
| 前BDNF | 阿洛莫内 | AGP-032型 | 1:300 |
| mBDNF型 | 阿布卡姆 | 约108319 | 1:1000 |
| 前-NGF | 阿洛蒙 | AGP-031型 | 1:300 |
| NGF公司 | 阿洛蒙 | AN-240型 | 1:300 |
| 神经生长因子受体 | 阿洛蒙 | 安特-018 | 1:300 |
| TrkB公司 | 阿洛蒙 | 安特019 | 1:400 |
| 第75页NTR公司
| 阿洛蒙 | ANT-007（安特-007） | 1:300 |
| Sortilin公司 | 阿洛蒙 | ANT-009（安特-009） | 1:500 |
| 伊巴1 | 阿布卡姆 | 约5076 | 1:1000 |
| 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 | 细胞信号 | 14220秒 | 1:1000 |
| CD206型 | 阿布卡姆 | ab125028号 | 1:1000 |
| CD86型 | 圣克鲁斯生物技术 | sc-28347号文件 | 下午1:300 |
| MAP2（神经元标记物） | 阿布卡姆 | 约5392 | 1:1000 |
| 山羊抗豚鼠（HRP） | 阿布卡姆 | 约97155 | 1:10,000 |
| 山羊抗兔（HRP） | 阿布卡姆 | ab6721号 | 1:5000 |
| 驴抗羊 | 阿布卡姆 | ab97120型 | 1:10,000 |
| 山羊抗鸡（Alexa Fluor 488） | 阿布卡姆 | 约150173 | 1:300 |
| 驴抗兔（德克萨斯红） | 阿布卡姆 | 约6800 | 1:1000 |
4.8. 实时qPCR
再灌注24小时后处死大鼠；立即移除大脑，并选择大脑结构：分离额叶皮层、海马和背侧纹状体，并在4°C的Fix-RNA稳定溶液（波兰Eurx）中浸泡24小时，以保存RNA。在Extracol（波兰Eur x）中均匀化大脑结构使用珠子均质器（bead Ruptor 24 Elite，Omni International），根据制造商的协议，使用基因矩阵通用纯化试剂盒（Eurx，Poland）从获得的匀浆中分离和纯化总RNA。验证了分离的RNA的整合和浓度，并将分离的RNA储存在−80°C下，直到使用。使用CFX Connect实时系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行反转录反应和实时PCR。根据制造商的程序，使用智能第一链cDNA合成试剂盒（波兰Eurx）将总RNA转录成cDNA。获得的cDNA在使用前保存在−80°C。根据制造商协议，使用商用TaqMan基因表达分析（Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）测定所选基因的相对表达(). 根据制造商的程序，使用Pro-qPCR主混合物（Eurx，Poland）进行实时PCR。将每个基因的表达水平归一化为参考基因水平；使用相对定量的ΔΔc（t）方法测定表达中的折叠变化。
表2
用于RT-PCR实验的TaqMan表达分析，包括用于结果归一化的家政基因（HKG）。
| 基因 | 分析ID： |
|---|
|
Ngf公司
| 01533872_m1卢比 |
|
Bdnf公司
| 卢比01484924_m1 |
|
伊尔-6
| 00561420_ml卢比 |
|
Il-1ß
| 00580432_m1卢比 |
|
T型
核燃料分析
| 99999017_m1卢比 |
|
伊尔-10
| 99999012_m1卢比 |
| Ppia公司-香港 | 0690933_m1卢比 |
| 伊瓦兹-香港 | 00755072_ml卢比 |
| Hprt1（小时）-香港 | 01527840_m1卢比 |
4.9. 免疫荧光双染色的组织固定
用于免疫荧光染色的动物组在手术后24小时接受4%多聚甲醛（PFA）心内灌注。首先，用氯胺酮（80 mg/kg）和木聚嗪（20 mg/kg）对动物进行深度麻醉。然后，用250 mL氯化钠溶液（0.9%；32°C）经心灌注大鼠，直到清除所有剩余血液。接下来，在0.1-M PBS中向动物灌注500 mL 4%PFA。操作完成后，取出大脑，并将其保存在相同的4%PFA溶液中过夜。然后，将大脑转移到含有0.1%叠氮化钠溶液的10%蔗糖溶液中（0.1-M PBS中），并保存24小时。然后，将脑转移到20%蔗糖溶液中，然后转移到含有30%叠氮化钠的30%蔗糖溶液中的0.1-M PBS中，并保存到每次下沉为止。接下来，使用自动冷冻刀（徕卡CM 1860）将大脑切割成10μm冠状切片。将切片附在SuperFrost（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）显微镜载玻片上，并保存在−20°C下，直到染色和分析。
4.10. 免疫荧光双染色
在半胱氨酸天冬氨酸酶3染色之前，用柠檬酸三钠（pH=9）进行热诱导抗原回收。切片在TBS中清洗两次，并在室温下的振动筛上在TBS的0.3%Triton X-100中渗透30分钟。然后，在室温下，在0.1%Triton X-100%的TBS中使用10%的正常血清封闭抗体的非特异性结合1小时。接下来，在去除封闭溶液后，切片与特异性初级抗体一起孵育(，抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和抗MAP-2，一种神经元标记物），并在2–8°C的振动筛上在TBS中0.1%Triton X-100的2%正常血清中溶解过夜。第二天，将载玻片在室温下的摇床上培养一个小时。然后，取下抗体溶液，在TBS中0.1%Triton X-100中2%的特异性正常血清中清洗玻片两次。然后，将与FITC或TexasRed结合的特异性二级抗体混合物溶解在TBS的0.1%Trito X-100中，添加到切片中，并在室温下的摇床上黑暗培养3小时。在此之后，将载玻片在0.1%Triton X-100中的TBS中清洗两次。然后，将载片安装在带有DAPI（Sigma-Aldrich）的荧光场安装介质中，并使用特定通道，使用徕卡DMI8荧光倒置显微镜对载玻片进行扫描。使用徕卡DFC450C相机和徕卡LAS X软件捕捉到caspase 3活性形式的定位。
4.11。H的测量2S内容
H的生物可用生化形式2S、 包括游离和二硫苏糖醇（DTT）释放形式（如过硫化物），根据之前描述的单溴二苯醚（MBB）方法在大鼠大脑结构中进行测量，并进行了一些修改[79]. 简单地说，用冰镇Tris-HCl（100 mM；pH=8.5）以1:9的比例将大鼠大脑结构均匀化（Bead Ruptor 24 Elite，Omni International）(w个/v（v）)，然后以12000×克将上清液在−80°C下冷冻20分钟，直到第二天。确定游离和DTT释放的H2S、 将上清液在RT下解冻10分钟，然后用移液管移到两个琥珀色试管中（每个试管的体积为30µL）。向第一根试管中加入10μL 10mM DTT溶液，并将样品在37°C下在恒温块上温育15分钟，轻轻摇动。向第二个试管中添加10μL蒸馏水，并将样品置于冰上15分钟。然后，95μL衍生试剂混合物（乙腈中的20-mM MBB:2-mg/mL EDTA:100-mM TRIS-HCl（pH=8.5），35:10:50，v： v：v)已添加到两个样本中。在块状加热器上摇晃60分钟后，通过添加50μL含10%甲酸的冰镇乙腈停止反应，并将样品置于冰上5分钟。根据之前的建议，衍生化过程在20°C的黑暗中进行[80]. 在样品制备的最后一步中，加入20μL 1μg/mL缬沙坦溶液（内标-IS），在12000×克将1μL上清液注入LC-MS/MS系统（Exion LC AC HPLC耦合Sciex QTRAP 4500三重四极杆质谱仪，均来自美国华盛顿特区达纳赫公司）。硫化物二比曼（SDB；H的一种产物）的色谱分离2S衍生化）在Hypersil Gold上进行TM（TM）C18分析柱（2.1×50 mm，3µm；Thermo Scientific，美国），使用含有0.1%的流动相进行梯度洗脱(v（v）/v（v）)甲酸溶于乙腈和水中。正离子模式下的电喷雾电离（ESI）用于产生离子。质谱仪在选定的反应监测模式下以单位分辨率运行，监测质子化分子离子的转变米/z（z）415-193（CE=25 eV）和米/z（z）用于SDB的415–223（CE=31 eV）（第一对用作量词，第二对用作身份验证限定符）和米/z（z）IS为436–235（CE=42 eV）。离子源温度保持在500°C，离子喷雾电压设置为5500 V。幕气体（CUR）设置为40，碰撞气体（CAD）设置为中等。将25μL脑匀浆上清液与5μL SDB标准工作溶液（根据Wintner等人[81])以产生50、100、200、400、800、1600和3200 nM的最终浓度，并在添加10μL H后2O、 95μL不含MBB的试剂混合物（乙腈：2-mg/mL EDTA:100-mM TRIS-HCl（pH=8.5），35:10:50，v： v：v)，50μL含10%甲酸的冰镇乙腈和20μL IS，离心样品，将上清液注入LC-MS/MS系统。使用Analyst 1.7版软件完成数据采集和处理。通过绘制SDB峰面积与IS的比值与SDB浓度的比值，并通过加权（1/x·x）线性回归分析生成50至3200nM范围内的校准曲线(). 在大鼠大脑结构中检测到的浓度以nM表示。DTT释放H的浓度2通过减去基本SDB浓度（TRIS-HCl中DTT溶液的衍生化）和游离H浓度之和来计算S2H总量中的S2在用DTT预处理的相应样品中测定S。
硫化氢（H）分析2S） 在大鼠大脑结构中使用LC-MS/MS(A类)空白大鼠脑匀浆，加入800 nM浓度的SDB(B类)SHAM组大鼠海马匀浆计算H2S浓度=844 nM和(C类)用DTT预处理的SHAM组大鼠的相同海马匀浆计算H2S浓度=2600 nM。SDB 1：米/z（z）=415/193和SDB 2：米/z（z）=415/223。
4.12. 统计
所有数据均以平均值±SEM表示。梗死体积、蛋白和mRNA表达以及H水平2S采用单因素方差分析。如果通过ANOVA分析发现统计显著性，则使用Sidak的事后检验来测试比较。A Mann–惠特尼U型测试用于分析神经功能缺损。第页<0.05被认为具有统计学意义。使用适用于Mac电脑的GraphPad Prism 8.01版软件进行统计分析（美国加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad）。
5.结论
总之，我们的研究证实了AP39和线粒体靶向硫化物方法在局灶性脑缺血动物模型中的有益作用。该研究表明AP39具有抗炎活性，对神经营养因子及其信号通路具有调节作用。神经营养信号通路的增强可能导致caspase 3激活减少，随后细胞损伤减少。重复给予低剂量缓释和线粒体靶向H2S供体保留了游离H2缺血24小时后，S处于基础水平，并增加h的结合分数2S、 它主要由过硫化蛋白组成。
致谢
Strach Beata感谢与项目POWR.03.02.00-00-I013/16的合作。
作者贡献
概念化，B.P.，B.B.，J.P。；方法学，B.P.、W.K.、J.J.、A.S.、B.S。；验证、W.K.、M.S.和K.P.-P。；形式分析，B.P.，W.K.，J.P。；调查、B.P.、W.K.、J.J.、A.S.、B.S。；资源、B.P.、M.M.、R.T.、M.W。；数据管理，业务伙伴。；编写初稿，B.B.、J.P.、B.B.、M.W。；写作与编辑，B.P.、M.W.、B.B.、J.P.、K.P.-P.、M.S。；可视化，B.P.，W.K。；监管，B.P.，J.P.，B.B。；项目管理，B.P.，W.K。；资金收购，B.P.所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
本研究得到了波兰国家科学中心（批准号：2016/21/D/NZ4/03302）和英国医学研究委员会（MR/S002626/1）的支持。
机构审查委员会声明
该研究是根据赫尔辛基宣言的指导方针进行的，并于2017年1月19日获得波兰克拉科夫波兰科学院药理研究所第二地方伦理委员会的批准（项目代码11/2017）。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。M.W.、R.T.和埃克塞特大学拥有与硫化氢递送分子及其治疗用途相关的知识产权（已授予和正在申请专利）。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
工具书类
1Feigin V.L.、Lawes C.M.、Bennett D.A.、Barker-Collo S.L.、Parag V.在56项基于人群的研究中报告的全球中风发病率和早期病死率：一项系统综述。《柳叶刀神经》。2009;8:355–369. doi:10.1016/S1474-4422（09）70025-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Berge E.、Whiteley W.、Audebert H.、Marchis G.M.D.、Fonseca A.C.、Padiglioni C.、Ossa N.P.D.l.、Strbian D.、Tsivgoulis G.、Turc G.欧洲卒中组织（ESO）急性缺血性卒中静脉溶栓指南。欧洲中风杂志。2021;6：I–LXII。doi:10.1177/2396987321989865。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Wang R.硫化氢的生理学意义：一个蓬勃发展的探索。生理学。版次。2012;92:791–896. doi:10.1152/physrev.00017.2011。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4硫化氢及其治疗潜力。Nat.Rev.药物发现。2007;6:917–935. doi:10.1038/nrd2425。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Moore P.K.、Bhatia M.、Moochhala S.《硫化氢：从过去的气味到未来的调解人？趋势药理学。科学。2003;24:609–611. doi:10.1016/j.tips.2003.10007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Abe K.，Kimura H.硫化氢作为内源性神经调节剂的可能作用。《神经科学杂志》。1996;16:1066–1071. doi:10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Kimura H.硫化氢和多硫化物在中枢神经系统中的生理作用。神经化学。国际。2013;63:492–497. doi:10.1016/j.neuint.2013.09.003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Marutani E.、Morita M.、Hirai S.、Kai S.，Grange R.M.H.、Miyazaki Y.、Nagashima F.、Traeger L.、Magliocca A.、Ida T.等。硫化物分解代谢改善缺氧性脑损伤。国家公社。2021;12：3108.doi:10.1038/s41467-021-23363-x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Goubern M.、Andriamihaja M.、Nübel T.、Blachier F.、Bouillaud F.硫化物，人类细胞的第一种无机基质。FASEB J。2007;21:1699–1706. doi:10.1096/fj.06-7407.com。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Theissen U.，Martin W.《硫化物：来自海生豚的醌氧化还原酶（SQR）显示出氰化物和硫氧还蛋白依赖性活性。2月J日。2008年；275:1131–1139. doi:10.1111/j.1742-4658.2008.06273.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11GerőD.、Torregrossa R.、Perry A.、Waters A.、Le-Trionnaire S.、Whatmore J.L.、Wood M.、Whiteman M.新型线粒体靶向硫化氢（H2S） 供体AP123和AP39在体外保护微血管内皮细胞免受高血糖损伤。药理学。物件。2016;113:186–198. doi:10.1016/j.phrs.2016.08.019。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Libiad M.、Vitvitsky V.、Bostelaar T.、Bak D.W.、Lee H.J.、Sakamoto N.、Fearon E.、Lyssiotis C.A.、Weerapana E.、Banerjee R.硫化氢干扰线粒体生物能量学并触发结肠细胞的代谢重编程。生物学杂志。化学。2019;294:12077–12090. doi:10.1074/jbc。拉119.009442。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Kimura H.硫化氢诱导环状AMP并调节NMDA受体。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。2000;267:129–133. doi:10.1006/bbrc.1999.1915。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Han Y.，Qin J.，Chang X.，Yang Z.，Bu D.，Du J.硫化氢对大鼠反复高热惊厥中γ-氨基丁酸B受体的调节作用。神经科学。物件。2005;53:216–219. doi:10.1016/j.neures.2005.07.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Whiteman M.、Cheung N.S.、Zhu Y.Z.、Chu S.H.、Siau J.L.、Wong B.S.、Armstrong J.S.、Moore P.K.硫化氢：一种新型的次氯酸介导的脑氧化损伤抑制剂？生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。2005;326:794–798. doi:10.1016/j.bbrc.2004.1110。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Kimura Y.，Kimura H.硫化氢保护神经元免受氧化应激。FASEB J。2004;18:1165–1167. doi:10.1096/fj.04-1815fje。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Kimura Y.，Goto Y.I.，Kimura H.硫化氢增加线粒体中谷胱甘肽的生成并抑制氧化应激。抗氧化剂。氧化还原信号。2010;12：1–13.doi:10.1089/ars.2008.2282。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Hu L.F.、Lu M.、Hon Wong P.T.、Bian J.S.《硫化氢：神经生理学和神经病理学》。抗氧化剂。氧化还原信号。2011;15:405–419. doi:10.1089/ars.2010.3517。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Seifert H.A.，Pennypacker K.R.缺血性脑损伤的分子和细胞免疫反应。Transl.公司。中风研究。2014;5:543–553. doi:10.1007/s12975-014-0349-7。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20王J.F.，李毅，宋建宁，庞华刚。硫化氢在继发性神经元损伤中的作用。神经化学。国际。2014;64:37–47. doi:10.1016/j.neuint.2013.11.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Whiteman M.、Winyard P.G.《硫化氢与炎症：好的、坏的、丑陋的和有希望的》。临床专家评论。药理学。2011;4：13–32。doi:10.1586/ecp.10.134。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Zhao F.L.，Fang F.，Qiao P.F.，Yan N.，Gao D.，Yan Y.AP39，线粒体靶向硫化氢供体，通过保护APP/PS1小鼠和神经元的线粒体功能来支持细胞生物能量学和预防阿尔茨海默病。氧化物。医学细胞。朗格夫。2016;2016doi:10.1155/2016/8360738。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23侯旭、袁毅、盛毅、袁斌、王毅、郑洁、刘长福、张旭、胡丽芳GYY4137、安H2S缓释供体，在帕金森病MPTP小鼠模型中防止硝化应激和α-突触核蛋白硝化。前面。药理学。2017;8：741.数字对象标识代码：10.3389/fphar.2017.00741。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Woo C.W.、Kwon J.I.、Kim K.W.、Kim J.K.、Jeon S.B.、Jung S.C.、Choi C.G.、Kin S.T.、KimJ.、Ham S.J.等。在急性卒中模型中，缺血再灌注前给予硫化氢具有神经保护作用。《公共科学图书馆·综合》。2017;12：e0187910.doi:10.1371/journal.pone.0187910。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25罗勇，杨欣，赵S.，魏C.，尹Y.，刘T.，蒋S.，谢J.，万欣，毛M.，等。硫化氢通过改善线粒体功能障碍和抑制皮层神经元中ROS介导的caspase-3通路来防止OGD/R诱导的凋亡。神经化学。国际。2013;63:826–831. doi:10.1016/j.neuint.2013.06.004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Tay A.S.、Hu L.F.、Lu M.、Wong P.T.H.、Bian J.S.硫化氢通过刺激ATP敏感性钾通道/蛋白激酶C/细胞外信号调节激酶/热休克蛋白90通路保护神经元免受缺氧损伤。神经科学。2010;167:277–286. doi:10.1016/j.neuroscience.2010.02.006。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Li G.F.，Luo H.K.，Li L.F.，Zhang Q.Z.，Xie L.J.，Jiang H.，Li L.P.，Hao N.，Wang W.W.，Zhang J.X.硫化氢通过调节氧化应激诱导的细胞凋亡对局灶性脑缺血损伤的双重作用。临床。实验药理学。生理学。2012;39:765–771. doi:10.1111/j.1440-1681.2012.05731.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Florian B.、Vintilescu R.、Balseanu A.T.、Buga A.M.、Grisk O.、Walker L.C.、Kessler C.、Popa-Wagner A.长期低温可减少老年大鼠局灶性缺血后的梗死体积。神经科学。莱特。2008年；438:180–185. doi:10.1016/j.neulet.2008.04.020。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29任C.，杜A.，李丹，隋J.，马汉W.G.，赵H.大鼠全脑缺血再灌注过程中硫化氢的动态变化及其影响。大脑研究。2010;1345:197–205. doi:10.1016/j.braines.2010.05.017。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Yin J.，Tu C.，Zhao J.，Ou D.，Chen G.，Liu Y.，Xiao X.外源性硫化氢通过其在大鼠体内的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用保护大鼠免受全脑缺血/再灌注损伤。大脑研究。2013;1491:188–196. doi:10.1016/j.braines.2012.10.46。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Gheibi S.、Aboutaleb N.、Khaksari M.、Kalalian-Moghaddam H.、Vakili A.、Asadi Y.、Mehrjerdi F.Z.、Gheibe A.在局灶性脑缺血的瞬态模型中，硫化氢保护大脑免受缺血再灌注损伤。《分子神经科学杂志》。2014;54:264–270. doi:10.1007/s12031-014-0284-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32吴丹，王杰，李海，薛明，季安，李勇。硫化氢在缺血再灌注损伤中的作用。氧化物。医学细胞。朗格夫。2015;2015：1–16.doi:10.1155/2015/186908。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Wu B.、Ootani A.、Iwakiri R.、Fujise T.、Tsunada S.、Toda S.、Fujimoto K.。缺血预处理通过抑制大鼠小肠中线粒体依赖性通路来减弱缺血再灌注诱导的粘膜凋亡。美国生理学杂志。胃肠测试。肝脏生理学。2004;286：G580–G587。doi:10.1152/ajpgi.00335.2003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Wang R.硫化氢：生物和医学中的第三种气体递质。抗氧化剂。氧化还原信号。2010;12:1061–1064. doi:10.1089/ars.2009.2938。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35潘铁东、尼奥·科勒、胡丽芙、永庆群、卞建生2S预处理诱导的PKC激活调节大鼠心肌细胞内钙的处理。美国生理学杂志。细胞生理学。2008年；294：C169–C177。doi:10.1152/ajpcell.00282.2007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36杜杰，金宏，杨莉。硫化氢在视网膜疾病中的作用。前面。药理学。2017;8：588。doi:10.3389/fpar.2017.00588。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37季瑜，李瑜，赵姿，李萍，谢瑜。高同型半胱氨酸血症下急性缺血性脑损伤与硫化氢过量产生有关。前面。神经科学。2020;14：1224.网址：10.3389/fnins.2020.582851。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Qu K.，Chen C.P.L.H.，Halliwell B.，Moore P.K.，Wong P.T.H.硫化氢是脑缺血损伤的介质。(打、击等的)一下。2006;37:889–893. doi:10.1161/01.STR.0000204184.34946.41。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Le Trionnaire S.、Perry A.、Szczesny B.、Szabo C.、Winyard P.G.、Whatmore J.L.、Wood M.E.、Whiteman M.线粒体靶向硫化氢供体（10-oxo-10-（4-（3-硫氧基-3H-1,2-二硫醇-5-基）苯氧基）癸基）三苯基溴化鏻（AP39）的合成和功能评估Medchemcomm公司。2014;5:728–736. doi:10.1039/C3MD00323J。[交叉参考][谷歌学者] 40Zemke D.、Smith J.L.、Reeves M.J.、Majid A.脑缺血与缺血耐受：综述。神经毒理学。2004;25:895–904. doi:10.1016/j.neuro.2004.03.009。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41季凯，薛立，程杰，白玉。H的预处理2吸入S通过PI3K/Akt/Nrf2途径诱导HSP70，从而保护脑缺血/再灌注损伤。大脑研究公牛。2016;121:68–74. doi:10.1016/j.brainresbull.2015.12.007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 42Krzyzanowska W.、Pomierny B.、Budziszewska B.、Filip M.、Pera J.N-乙酰半胱氨酸和头孢曲松作为局灶性脑缺血预处理策略：对谷氨酸转运蛋白表达的影响。神经毒素。物件。2016;29:539–550. doi:10.1007/s12640-016-9602-z。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 43Krzyżanowska W.、Pomierny B.、Bystrowska B.、Pomierry-Chamioło L.、Filip M.、Budziszewska B.、Pera J.Ceftriaxone和N-乙酰半胱氨酸诱导的脑缺血耐受性：对局灶性脑缺血中谷氨酸水平的影响。《公共科学图书馆·综合》。2017;12：e0186243.doi:10.1371/journal.pone.0186243。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 44Shah F.A.、Li T.、Kury L.T.A.、Zeb A.、Khatoon S.、Liu G.、Yang X.、Liu F.、Yao H.、Khan A.U.等。短暂性和永久性大脑中动脉闭塞大鼠模型海马变化的病理学比较。前面。Neurol公司。2019;10：1178.doi:10.3389/fneur.2019.01178。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 45Weinstein P.R.，Hong S.，Sharp F.R.缺血性半影的分子鉴定。(打、击等的)一下。2004;35:2666–2670. doi:10.1161/01.STR.000144052.10644.ed。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 46Wahul A.B.、Joshi P.C.、Kumar A.、Chakravarty S.在双侧颈总动脉闭塞（BCCAo）小鼠模型中，短暂性全脑缺血对皮层、纹状体和海马的影响不同。化学杂志。神经酸盐。2018;92：1-15.doi:10.1016/j.chemneu.2018.04.006。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 47Pawluk H.、Woźniak A.、Grze shi k G.、Kołodziejska R.、Kozakiewicz M.、Kopkowska E.、Grzechowiak E.、Kozera G.选定的促炎细胞因子在缺血性卒中发病机制中的作用。临床。Interv公司。老化。2020;15：469–484。doi:10.2147/CIA。S233909。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 48Fouda A.Y.，Kozak A.，Alhusban A.，Switzer J.A.，Fagan S.C.实验性缺血性卒中后，两个半球的抗炎症IL-10上调：高血压减弱反应。Exp.Transl.公司。中风医学。2013;5：1-7.数字对象标识代码：10.1186/2040-7378-5-12。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 49Baron J.C.、Yamauchi H.、Fujioka M.、Endres M.缺血性中风和脑血管疾病中的选择性神经元缺失。J.塞雷布。血流代谢。2014;34：2–18.doi:10.1038/jcbfm.2013.188。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 50Szczesny B.、Módis K.、Yanagi K.，Coletta C.、Le Trionnaire S.、Perry A.、Wood M.E.、Whiteman M.、Szabo C.AP39是一种新型线粒体靶向硫化氢供体，刺激细胞生物能学，发挥细胞保护作用，防止体外氧化应激内皮细胞线粒体DNA完整性的丧失。一氧化氮生物。化学。2014;41:120–130. doi:10.1016/j.niox.2014.04.008。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 51Szabo C.、Ransy C.、Módis K.、Andriamihaja M.、Murghes B.、Coletta C.、Olah G.、Yanagi K.和Bouillaud F.硫化氢对线粒体生物能量功能的调节。第一部分生化和生理机制。Br.J.药理学。2014;171:2099–2122. doi:10.1111/bph.12369。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 52Yong R.，Searcy D.G.鸡肝线粒体中硫化物氧化与ATP合成耦合。公司。生物化学。生理学。B生物化学。分子生物学。2001;129:129–137. doi:10.1016/S1096-4959（01）00309-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 53Zivanovic J.、Kouroussis E.、Kohl J.B.、Adhikari B.、Bursac B.、Schott-Roux S.、Petrovic D.、Miljkovic J.L.、Thomas-Lopez D.、Jung Y.等人。选择性过硫化物检测揭示了S-硫水合物的进化保护抗衰老作用。单元格元数据。2019;30：1152–1170.e13。doi:10.1016/j.cmet.2019.10.007。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 54Wedmann R.、Onderka C.、Wei S.、SzijártóI.A.、Miljkovic J.L.、Mitrovic A.、Lange M.、Savitsky S.、Yadav P.K.、Torregrossa R.等。改进的标记开关方法揭示了硫氧还蛋白作为脱硫酶发挥作用，并控制细胞内蛋白质过硫化水平。化学。科学。2016;7:3414–3426. doi:10.1039/C5SC04818D。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 55Aroca A.、Benito J.M.、Gotor C.、Romero L.C.过硫化蛋白质组揭示了硫化氢在拟南芥不同生物过程中对蛋白质功能的调节。J.Exp.机器人。2017;68:4915–4927. doi:10.1093/jxb/erx294。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 56Linden D.R.、Furne J.、Stoltz G.J.、Abdel-Rehim M.S.、Levitt M.D.、Szurszewski J.H.硫化醌还原酶有助于小鼠外周组织中的硫化氢代谢，但不影响中枢神经系统。Br.J.药理学。2012;165:2178–2190. doi:10.1111/j.1476-5381.2011.01681.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 57Kanazawa M.、Ninomiya I.、Hatakeyama M.、Takahashi T.、Shimohata T.小胶质细胞和单核细胞/巨噬细胞极化揭示了新的中风治疗机制。国际分子科学杂志。2017;18：2135.doi:10.3390/ijms18102135。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 58张伟、田涛、龚S.X.、黄伟强、周庆友、王安平、田勇。小胶质细胞相关神经炎症是缺血性中风的潜在治疗靶点。神经再生。物件。2021;16：6-11.doi:10.4103/1673-5374.286954。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 59Liu C.，Yang J.，Zhang C.，Geng X.，Zhao H.远程缺血预处理通过调节2型糖尿病小鼠的炎症反应和ERK活性来减轻脑缺血损伤。神经化学。国际。2020;135：104690.doi:10.1016/j.neuint.2020.104690。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 60Pera J.、Zawadzka M.、Kaminska B.、Szczudlik A.化学和缺血预处理对局灶性脑缺血后细胞因子表达的影响。《神经科学杂志》。物件。2004;78:132–140. doi:10.1002/jnr.20232。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 61Spera P.A.、Ellison J.A.、Feuerstein G.Z.、Barone F.C.IL-10可减轻大鼠局灶性脑卒中后的脑损伤。神经科学。莱特。1998;251:189–192. doi:10.1016/S0304-3940（98）00537-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 62Sabat R.、Grütz G.、Warszawska K.、Kirsch S.、Witte E.、Wolk K.、Geginat J.白细胞介素-10生物学。细胞因子生长因子评论。2010;21:331–344. doi:10.1016/j.cytogfr.2010.09.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 63江春涛，吴伟峰，邓玉华，葛J.W.缺血性脑卒中小胶质细胞激活和极化调节剂（综述）摩尔医学代表。2020;21:2006–2018. doi:10.3892/mmr.2020.11003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 64Yenari M.A.、Kauppinen T.M.、Swanson R.A.中风中的小胶质细胞激活：治疗靶点。神经疗法。2010;7:378–391. doi:10.1016/j.nurt.2010.07.005。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 65Hu L.F.，Wong P.T.H.，Moore P.K.，Bian J.S.硫化氢通过抑制小胶质细胞中p38有丝分裂原活化蛋白激酶减轻脂多糖诱导的炎症。神经化学杂志。2007;100:1121–1128. doi:10.1111/j.1471-4159.2006.04283.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 66Castrén E.，Antila H.药物反应中的神经元可塑性和神经营养因子。摩尔精神病学。2017;22:1085–1095. doi:10.1038/mp.2017.61。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 67Lee R.，Kermani P.，Teng K.K.，Hempstead B.L.分泌的前神经营养素对细胞存活的调节。科学（80-）2001;294:1945–1948. doi:10.1126/science.1065057。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 68Gehler S.、Gallo G.、Veien E.、Letourneau P.C.p75神经营养素受体信号通过调节RhoA活性调节生长锥丝足动力学。《神经科学杂志》。2004;24:4363–4372. doi:10.1523/JNEUROSCI.0404-04.2004。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 69Jiang J.M.，Zhou C.F.，Gao S.L.，Tian Y.，Wang C.Y.，Wang L.，Gu H.F.，Tang X.Q.BDNF TrkB通路介导硫化氢对甲醛诱导的PC12细胞毒性的神经保护作用。《公共科学图书馆·综合》。2015;10：e0119478.doi:10.1371/journal.pone.0119478。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 70Matsuda F.、Sakakima H.、Yoshida Y.早期运动对大鼠局灶性脑梗死后脑损伤和恢复的影响。生理学报。2010年doi:10.1111/j.1748-1708.2010.02174.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 71Yang J.P.，Liu H.J.，Yang H.，Feng P.Y.局灶性脑缺血后NGF神经保护作用的治疗时间窗。神经醇。科学。2011;32:433–441. doi:10.1007/s10072-011-0512-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 72Nykjaer A.、Lee R.、Teng K.K.、Jansen P.、Madsen P.，Nielsen M.S.、Jacobsen C.、Kliemannel M.、Schwarz E.、Willnow T.E.等。Sortilin对proNGF诱导的神经元细胞死亡至关重要。自然。2004;427:843–848. doi:10.1038/nature02319。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 73McAllister A.K.，Katz L.C.，Lo D.C.神经营养素对皮层树突生长的调节需要活性。神经元。1996;17:1057–1064. doi:10.1016/S0896-6273（00）80239-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 74Cohen-Cory S.，Fraser S.E.脑源性神经营养因子对体内视神经轴突分支和重塑的影响。自然。1995;378:192–196. doi:10.1038/378192a0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 75Datta A.、Sarmah D.、Mounica L.、Kaur H.、Kesharwani R.、Verma G.、Veeresh P.、Kotian V.、Kalia K.、Borah A.等人，《缺血性中风中的细胞死亡途径和靶向药物治疗》。Transl.公司。中风研究。2020;11:1185–1202. doi:10.1007/s12975-020-00806-z。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 76Nitatori T.、Sato N.、Waguri S.、Karasawa Y.、Araki H.、Shibanai K.、Kominami E.、Uchiyama Y.沙土鼠海马CA1锥体细胞层短暂缺血后的延迟神经元死亡是凋亡。《神经科学杂志》。1995;15:1001–1011. doi:10.1523/JNEUROSCI.15-02-01001.1995。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 77Longa E.Z.、Weinstein P.R.、Carlson S.、Cummins R.大鼠大脑中动脉可逆闭塞，无需开颅手术。(打、击等的)一下。1989;20：84–91。doi:10.1161/01.STR.201.84。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 78Phillips J.B.、Williams A.J.、Adams J.、Elliott P.J.、Tortella F.C.蛋白酶体抑制剂PS519在大鼠局灶性脑缺血模型中减少梗死并减轻白细胞浸润。(打、击等的)一下。2000;31:1686–1693. doi:10.1161/01.STR.31.7.1686。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 79Tan B.，Jin S.，Sun J.，Gu Z.，Sun X.，Zhu Y.，Huo K.，Cao Z.，Yang P.，Xin X.，et al.LC-MS/MS定量生物基质中气体传递物硫化氢的新方法。科学。众议员。2017;7：46278.doi:10.1038/srep46278。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 80Ditrói T.、Nagy A.、Martinelli D.、Rosta A.、Koíich V.和Nagy P.关于实验参数如何影响单溴二苯醚法测量H2 S的综合分析。自由基。生物医学。2019;136：146–158。doi:10.1016/j.freeradbiomed.2019.04.006。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 81Wintner E.A.、Deckwerth T.L.、Langston W.、Bengtsson A.、Leviten D.、Hill P.、Insko M.A.、Dumpit R.、Vandenekart E.、Toombs C.F.等人。一种基于单溴双歧杆菌的测定血液中活性硫化物药物代谢动力学的方法。Br.J.药理学。2010;160:941–957. doi:10.1111/j.1476-5381.2010.00704.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
