cGAS-STING cytosolic DNA sensing pathway is suppressed by JAK2-STAT3 in tumor cells

doi:10.1038/s41598-021-86644-x

.2021年3月31日；11(1):7243.

doi:10.1038/s41598-021-86644-x。

JAK2-STAT3抑制肿瘤细胞中cGAS-STING细胞溶质DNA感应通路

曼纽尔·阿德里安·苏特¹, Nikki Y Tan（尼基·Y·谭）¹, Chung Hwee Thiam公司¹, 穆兹纳·卡托¹, 保罗·A·麦卡里¹, 维罗妮克·安吉丽¹, 斯蒂芬·加斯尔^1 2, 张亚雷^三

附属公司

¹新加坡国立大学免疫学系，新加坡，117456。
²新加坡国立大学新加坡国立大学综合科学与工程研究生院，新加坡，117597。
^三新加坡国立大学免疫学系，新加坡，117456。zhang.ya.ling@qq.com。

PMID： 33790360
预防性维修识别码： PMC8012641
内政部： 10.1038/s41598-021-86644-x

JAK2-STAT3抑制肿瘤细胞中cGAS-STING细胞溶质DNA感应通路

曼纽尔·阿德里安·苏特等。科学代表. 2021.

.2021年3月31日；11(1):7243.

doi:10.1038/s41598-021-86644-x。

作者

附属公司

¹新加坡国立大学免疫学系，新加坡，117456。
²新加坡国立大学新加坡国立大学综合科学与工程研究生院，新加坡，117597。
^三新加坡国立大学免疫学系，新加坡，117456。zhang.ya.ling@qq.com。

PMID： 33790360
预防性维修识别码： PMC8012641
内政部： 10.1038/s41598-021-86644-x

摘要

DNA修复和DNA降解核酸酶的缺陷导致胞质DNA的积累。cGAS是检测细胞溶质DNA和随后激活STING信号通路的关键DNA传感器。在这里，我们发现cGAS-STING通路对STING激动剂无反应，并且未能在包括DU145前列腺癌细胞在内的许多受试人类肿瘤细胞中诱导I型干扰素（IFN）表达。抑制IL-6或下游JAK2/STAT3信号可恢复DU145细胞对STING激动剂的反应性。小鼠TRAMP-C2前列腺癌细胞的STING活性对肿瘤排斥和免疫细胞浸润至关重要。内源性STING激动剂包括双链DNA和RNA：存在于TRAMP-C2细胞中的DNA杂交有助于肿瘤排斥反应，但cGAMP的使用进一步抑制了肿瘤生长。肿瘤内联合注射IL-6显著降低cGAMP的抗肿瘤作用。总之，肿瘤细胞中的STING有助于前列腺癌细胞的肿瘤排斥反应，但其功能经常在肿瘤细胞中部分通过JAK2和STAT3途径受到抑制。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
STING信号传导在大多数测试的人类肿瘤细胞系中存在缺陷。(一个)用PBS（ctrl）、2μg/ml ISD或2μg/ml cGAMP（cGa）处理小鼠TRAMP-C2前列腺癌细胞、人THP-1白血病细胞、人DU145前列腺癌细胞，人A549肺癌细胞、人HeLa宫颈腺癌细胞和人HCT116结直肠癌细胞4h。通过共焦显微镜分析处理细胞中内源性IRF3的表达（绿色）。比例尺表示所有图像中的10μm。(B类)用PBS（ctrl）、2μg/ml ISD或2μg/ml cGAMP（cGa）处理TRAMP-C2、THP-1、DU145、A549、HeLa和HCT116细胞4h。分析处理后的细胞内源性表达*国际单项体育联合会*（黑色列）和*国际单项体育联合会*实时PCR的（白色列）转录本。表达值归一化为PBS（ctrl）处理的细胞。(C类)A549、HeLa、HCT116、DU145和THP-1细胞中cGAS、STING、TBK1、IKKe、IRF3和GAPDH水平的免疫印迹分析。将细胞裂解物等分并装入不同的凝胶中。从同一凝胶的不同部分或不同凝胶中截取斑点分组。数据代表了3个独立实验。(D类)用25μM Poly（I:C）处理A549、HeLa、HCT116、DU145和THP-1细胞4 h。分析处理后的细胞表达*国际单项体育联合会*（白色列）和*CXCL10系列*（灰栏）实时PCR转录本。将表达值标准化为模拟处理的细胞。数据以平均值表示 ± 3个独立实验的SD。

图2
细胞质DNA水平与人类肿瘤细胞的STING功能障碍无关。(一个)对TRAMP-C2、THP-1、DU145、A549、HeLa和HCT116细胞进行dsDNA或RNA:S9.6抗体识别的DNA杂交体（红色）和DAPI（蓝色）染色。(B类)A549细胞裂解液中的细胞溶胶dsDNA（左图）和RNA:DNA杂交体（右图）用dsDNA-特异性或S9.6抗体进行免疫沉淀。使用cGAS特异性抗体对沉淀进行免疫印迹。在洗脱之前，用20单位的DNase或RNaseH处理部分裂解液。所示的斑点是3个独立实验的代表。(C类)A549或HCT116细胞被逆转录病毒编码转导*蝶呤-1*或对照载体，在DAPI（蓝色）存在下对dsDNA（红色）进行染色。条形图显示dsDNA MFI的量化 ± SD输入*TREX1公司-*（白柱）和对照（黑柱）转导A549和HCT116细胞。将值归一化为对照细胞中的MFI.另请参见图S3。(D类)*RNASEH1（RNH）*-或对照转导的A549和HCT116细胞在DAPI（蓝色）存在下进行RNA:DNA杂交（红色）染色。条形图显示RNA:DNA杂交MFI的量化 ± SD输入*RNASEH1（RNH）-*（白柱）和对照（黑柱）转导A549和HCT116细胞。将值归一化为对照细胞中的MFI.另请参见图S3。(E类)*国际单项体育联合会*（黑色列），*国际单项体育联合会*（白色列）和*CXCL10系列*（灰色列）转录水平*TREX1公司-*或*rna序列1（RNH）-*实时PCR检测转导的A549和HCT116细胞。转录水平归一化为对照转导细胞中的转录水平。(F类)*TREX1公司-*和*RNASEH1（RNH）-*用PBS（Ctrl）或2μg/ml cGAMP（cGa）处理转导的A549和HCT116细胞4h。*国际单项体育联合会*（黑色列）和*国际单项体育联合会*通过实时PCR测量（白柱）转录物水平，并将其标准化为对照细胞。比例尺表示所有图像中的10μm。所有数据均表示为平均值 ± 3个独立实验的SD。

图3
cGAS不会导致人类癌细胞STING功能障碍。(一个)免疫印迹分析转染对照siRNA或*cGAS公司*-特异性siRNA和cGAS缺陷（cGAS^CRISPR公司)或控制（cGAS^CTRL键)A549、HeLa和HCT116细胞。(B类)在DAPI（蓝色）存在下对cGAS缺陷型和野生型癌细胞进行cGAS（绿色）染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。比例尺表示10μm。(C类)*国际单项体育联合会*（黑色列），*国际单项体育联合会*（白色列）和*CXCL10系列*通过实时PCR测定cGAS缺失和cGAS表达TRAMP-C2、DU145、A549、HeLa和HCT116细胞的（灰柱）转录水平。转录水平被归一化为相应对照细胞的水平。(D类)cGAS公司^Ctrl键和cGAS^CRISPR公司用PBS（−）或2μg/ml cGAMP处理A549、HeLa和HCT116细胞4 h，然后测量*国际单项体育联合会*（黑色列）和*国际单项体育联合会*实时PCR检测（白柱）转录水平。转录水平被归一化为未经处理的cGAS表达细胞的水平。所有数据均表示平均值 ± 3个独立实验的SD。

图4
JAK2/STAT3通路导致肿瘤细胞STING功能障碍。(一个)用PBS（−）、2μg/ml cGAMP和/或7μM WP1066处理A549、HeLa、HCT116和DU145细胞4小时。分析处理后的细胞表达*国际单项体育联合会*（黑色列）和*国际单项体育联合会*（白柱）通过实时PCR的转录物。表达值归一化为PBS处理的细胞。数据代表了3个独立实验。比例尺表示10μm。(B类)A549、HeLa、HCT116和DU145细胞在1μg/ml IL-6中和抗体或同型控制抗体存在下培养24 h，然后用2μg/ml cGAMP或PBS刺激4 h。分析处理后的细胞表达*国际单项体育联合会*（黑色列）和*国际单项体育联合会*（白柱）通过实时PCR的转录物。表达值归一化为PBS处理的细胞。(C类)DU145、A549、HeLa和HCT116细胞在DAPI（蓝色）存在下磷酸化STAT3（红色）染色的典型共焦显微镜图像。细胞在1μg/ml IL-6中和抗体或同种对照抗体存在下培养。下面的条形图显示了控制和治疗的癌细胞中核磷酸化STAT3病灶数量的量化。

图5
肿瘤细胞中STING的激活有助于控制肿瘤生长和肿瘤微环境的炎症。(一个)小鼠STING的免疫印迹分析^CTRL键和STING^CRISPR公司用STING和β-微管蛋白抗体检测TRAMP-C2前列腺癌细胞。刺痛^CTRL键和STING^CRISPR公司用PBS（ctrl）、2μg/ml ISD或2μg/ml cGAMP处理TRAMP-C2细胞4h。分析处理后的细胞表达*伊夫纳*（黑色列）和*Ifnb公司*实时PCR的（白色列）转录本。表达值归一化为PBS（ctrl）处理的细胞。(B类)雄性C57BL/6小鼠（n = 每组10只）皮下注射5只 × 10⁶STING表达（STING^CTRL键; 方块）或STING不足（STING^CRISPR公司; 圆形）TRAMP-C2细胞。小鼠接受肿瘤内注射(B类)PBS（黑色符号）或(C类)注射TRAMP-C2细胞后第14、17、20、25、28、32、34天，服用25μg cGAMP（红色符号）。在指定的时间点测量肿瘤体积。进行了三个独立的实验，数据显示为平均值 ± 标准偏差(C类)第34天切除的皮下前列腺肿瘤的代表性图像(D类)STING表达（黑柱）和STING缺乏（白柱）TRAMP-C2肿瘤(C类)染色并量化CD45的百分比⁺，CD11c⁺或CD8α⁺每个切片中所有DAPI阳性细胞中的细胞（每个染色10个切片，n ≥ 分析1000个细胞）。数据以平均值表示 ± 3个独立实验的SD。(E类)TRAMP-C2细胞在0.1μg/ml IL-6重组蛋白存在下培养24 h，然后用2μg/ml cGAMP或PBS（−）处理4 h。分析处理后的细胞表达*国际单项体育联合会*（黑色列）和*国际单项体育联合会*实时PCR的（白色列）转录本。表达值归一化为PBS（ctrl）处理的细胞。(F类)雄性C57BL/6小鼠（n = 每组3个）皮下注射7 × 10⁶TRAMP-C2细胞。在肿瘤细胞注射后第14、17、20、25、28、32、34天，对小鼠进行瘤内注射PBS（圆形）、75 ng小鼠IL-6（方形）、25μg cGAMP（三角形）或75 ng小鼠IL-6，并结合25μg c GAMP（倒三角形）。在指定的时间点测量肿瘤体积。数据代表了3个独立实验。

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[10] Zhong B等。衔接蛋白MITA将病毒敏感受体与IRF3转录因子激活联系起来。免疫。2008;29(4):538–550. doi:10.1016/j.immuni.2008.09.003。-内政部-公共医学

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