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.2021年5月；23(5):366.
doi:10.3892/mmr.2021.12005年。 Epub 2021年3月24日。

LINC01116通过调节microRNA‑744‑5p‑MDM2‑p53轴促进胶质瘤的增殖和侵袭

李江 # 1, 赵成 # 2, 魏基 # 2, 王浩（Hao Wang） 1, 全都 1, 董晓巧 1, 邵俊飞 2, 余文华 1
附属公司

LINC01116通过调节microRNA‑744‑5p‑MDM2‑p53轴促进胶质瘤的增殖和侵袭

李江等。 分子医学代表. 2021年5月.

摘要

长非编码RNA（lncRNAs）与肿瘤的发展和进展有关。然而，lncRNA家族成员长基因间非蛋白编码RNA 1116（LINC01116）在胶质瘤进展中的作用和潜在机制尚不清楚。采用逆转录定量PCR检测胶质瘤组织和细胞中LINC01116和microRNA（miR）‑744‑5p的表达。通过细胞计数试剂盒-8、集落形成和Transwell分析评估LINC01116或miR-744‑5p对细胞增殖和侵袭的影响，并使用蛋白质印迹检测p53通路蛋白的表达。使用双荧光素酶报告系统定位miR‑744‑5p与LINC01116或E3泛素蛋白连接酶Mdm2（Mdm2）的3'非翻译区之间的共同结合位点。RNA免疫沉淀用于测定RNA与蛋白质之间的相互作用。此外，还构建了异种小鼠模型来研究LINC01116的作用体内然后进行TdT‑介导的dUTP缺口末端标记试验，以确定裸鼠肿瘤的凋亡程度。LINC01116在胶质瘤组织中高表达，与恶性表型相关。LINC01116通过miR‑744‑5p海绵保护MDM2 mRNA的表达，促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭性，抑制p53通路。此外，在胶质瘤组织中观察到miR‑744‑5p的低表达，这与LINC01116的表达呈负相关。miR‑744‑5p的过度表达抑制了胶质瘤细胞的增殖和侵袭性，LINC01116对此进行了挽救。最后，LINC01116敲除抑制裸鼠肿瘤生长。总之，LINC01116异常表达，并通过调节miR‑744‑5p‑MDM2‑p53通路促进胶质瘤的进展。因此，在未来，靶向LINC01116可能是脑胶质瘤患者潜在的治疗方法。

关键词：胶质瘤；长基因间非蛋白编码RNA 1116；微RNA‑744‑5p；MDM2；p53通路；竞争内源性RNA。

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数字

图1。
图1。
LINC01116在神经胶质瘤中表达上调，可预测预后不良。（A） 使用GEPIA平台分析LINC01116在GBM和LGG中的相对表达。与正常脑组织相比，GBM组织中LINC01116的表达水平较高。（B-D）基于不同级别胶质瘤组织中LINC01116表达水平的总体生存分析也在GEPIA平台上进行分析。无论胶质瘤分级如何（即胶质瘤患者总数），LINC01116高表达患者的生存时间明显短于LINC01115低表达患者。（E） LINC01116在46例新鲜胶质瘤组织中的相对表达。II–III级胶质瘤（n=17）和GBM（n=29）的LINC01116表达水平均显著高于正常脑组织（n=4）。（F） LINC01116的表达与胶质瘤组织中Ki-67阳性细胞的百分比呈正相关（n=46）*P<0.05，***P<0.001。LINC01116，长基因间非蛋白编码RNA 1116；GBM，胶质母细胞瘤；LGG，低度胶质瘤；GEPIA，基因表达谱交互分析。
图2。
图2。
LINC01116促进胶质瘤的增殖和侵袭性。（A） LINC01116在HEB和神经胶质瘤细胞系（U87、A172和Shg44）中的相对表达。分别用Shg44和A172细胞构建了稳定的（B）LINC01116 KD和（C）LINC01126 OE细胞系。通过逆转录定量PCR评估稳定KD或OE细胞中LINC01116的相对表达。细胞计数试剂盒-8分析表明，（D）LINC01116 KD降低了Shg44细胞的增殖，而（E）LINC0111 OE促进了A172细胞的增殖。（F） LINC01116 KD和OE分别对Shg44和A172细胞的集落形成和侵袭能力的影响。直方图表示菌落和细胞的相对数量*与NC.LINC01116，长基因间非蛋白编码RNA 1116相比，P<0.05，**P<0.01和***P<0.001；KD，击倒；OE，过度表达；NC，阴性对照。
图3。
图3。
LINC01116在胶质瘤中介导MDM2-p53通路。（A） 基因表达谱交互分析显示，LINC01116水平与p53靶基因的mRNA水平呈负相关BAK1、BAX、CDKN1A和GADD45A公司GBM组织中（n=81）。（B和C）LINC01116调节MDM2、BAK1和G添加45A，但不是TP53型在胶质瘤细胞系中。（D） LINC01116可调节胶质瘤细胞中MDM2、p53、BAK1和GADD45A的蛋白表达。（E） 表示（D）中相对蛋白质水平的直方图。（F） LINC01116调节A172细胞中的p53通路，这依赖于MDM2的存在。（G） 表示（F）中相对蛋白质水平的直方图*与NC.LINC01116，长基因间非蛋白编码RNA 01116相比，P<0.05，**P<0.01和***P<0.001；MDM2，E3泛素蛋白连接酶MDM2；KD，击倒；OE，过度表达；NC，阴性对照；CDKN1A，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1；GADD45A、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白GADD45α。
图4。
图4。
LINC01116增加MDM2型胶质瘤中miR-744-5p的mRNA水平。（A） LINC01116在Shg44和A172细胞中负调控miR-744-5p的表达。（B） LINC01116和MDM2型在Shg44细胞中被miR-744-5p模拟物下调，而在A172细胞中则被miR-74 4-5p抑制剂上调。（C） LINC01116 OE部分挽救了MDM2型A172细胞中miR-744-5p模拟物下调mRNA和蛋白质。（D） miR-744-5p抑制剂部分获救MDM2型LINC01116 KD下调Shg44细胞mRNA和蛋白表达。（E） miR-744-5p和LINC01116或MDM2型WT和MUT序列中的mRNA 3′-UTR。（F） miR-744-5p显著降低293T细胞中WT LINC01116的荧光素酶活性，但不降低MUT序列的荧光素酶活性，并且荧光素素酶活性的降低被LINC01116OE挽救。（G） WT的荧光素酶活性MDM2型在293T细胞中，miR-744-5p模拟物显著降低了3′-UTR，但没有降低MUT。然而，miR-744-5p抑制剂并未显著改变LINC01116 WT或MUT质粒的荧光素酶活性。（H） RNA免疫沉淀分析表明，LINC01116和miR-744-5p均能结合Ago2*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。LINC01116，长基因间非蛋白编码RNA 01116；MDM2，E3泛素蛋白连接酶MDM2；miR，microRNA；KD，击倒；OE，过度表达；NC，阴性对照；UTR，非翻译区；WT，野生型；MUT，突变型。
图5。
图5。
miR-744-5p抑制胶质瘤的增殖和侵袭性，逆转LINC01116的生物学功能。（A） miR-744-5p在不同级别的胶质瘤中显著下调。（B） miR-744-5p的表达与胶质瘤组织中Ki-67的百分比呈负相关。（C） 不同胶质瘤细胞系中miR-744-5p的相对水平。在Shg44细胞中，miR-744-5p模拟物（D）降低了细胞增殖，而在A172细胞中，（E）miR-74-45p抑制剂上调了细胞增殖。（F） 脑胶质瘤组织中miR-744-5p的表达与LINC01116的表达呈负相关。（G） miR-744-5p模拟物可抑制Shg44细胞的集落形成和侵袭能力，而LINC01116的OE可逆转这种抑制。（H） 直方图表示菌落和细胞的相对数量。（一） miR-744-5p抑制剂促进了A172细胞的集落形成和侵袭能力，并部分恢复了LINC01116 KD抑制的这些行为。（J） 直方图表示菌落和细胞的相对数量*与NC.miR，microRNA相比，P<0.05，**P<0.01和***P<0.001；LINC01116，长基因间非蛋白编码RNA 1116；KD，击倒；OE，过度表达；NC，阴性对照。
图6。
图6。
LINC01116促进胶质瘤生成体内（A）LINC01116 KD抑制Shg44细胞瘤的生长。显示异种移植瘤平均重量的直方图（n=5）。肿瘤生长曲线折线图（n=5）。（B） LINC01116、miR-744-5p、，MDM2型和TP53型在指定的异种移植瘤中。（C） 异种移植瘤中BAK1、GADD45A、MDM2和p53的蛋白表达。（D） TUNEL分析检测异种移植瘤中胶质瘤细胞的凋亡。显示异种移植瘤中凋亡细胞百分比的直方图（n=5）。放大倍数，×20**与NC.LINC01116，长基因间非蛋白编码RNA 01116相比，P<0.01和***P<0.001；miR，microRNA；KD，击倒；NC，阴性对照；GADD45A、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白GADD45α；MDM2，E3泛素蛋白连接酶MDM2。
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参考文献

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