The chromosomal protein SMCHD1 regulates DNA methylation and the 2c-like state of embryonic stem cells by antagonizing TET proteins

doi:10.1126/sciadv.abb9149

.2021年1月20日；7（4）：eabb9149。

doi:10.1126/sciadv.abb9149。打印日期：2021年1月。

染色体蛋白SMCHD1通过拮抗TET蛋白调节胚胎干细胞的DNA甲基化和2c样状态

黄志军¹, 余继英（Jiyoung Yu）^1 2, 魏翠¹, 本杰明·约翰逊¹, 金京根（Kyunggon Kim）², Gerd P Pfeifer公司^三

附属公司

¹美国密歇根州49503大急流城Van Andel研究所表观遗传学中心。
²韩国首尔宋巴医学院蔚山大学阿桑医学中心。
^三美国密歇根州49503大急流城Van Andel研究所表观遗传学中心。gerd.pfeifer@vai.org。

PMID： 33523915
预防性维修识别码：项目管理委员会7817097
内政部： 10126年10月10日/夏令时上午9149

染色体蛋白SMCHD1通过拮抗TET蛋白调节胚胎干细胞的DNA甲基化和2c样状态

黄志军等。科技进步. 2021.

.2021年1月20日；7（4）：eabb9149。

doi:10.1126/sciadv.abb9149。打印日期：2021年1月。

作者

黄志军¹, 余继英（Jiyoung Yu）^1 2, 魏翠¹, 本杰明·约翰逊¹, 金京根（Kyunggon Kim）², Gerd P Pfeifer公司^三

附属公司

¹美国密歇根州49503大急流城Van Andel研究所表观遗传学中心。
²韩国首尔宋巴医学院蔚山大学阿桑医学中心。
^三美国密歇根州49503大急流城Van Andel研究所表观遗传学中心。gerd.pfeifer@vai.org。

PMID： 33523915
预防性维修识别码：项目管理委员会7817097
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摘要

5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化酶是十级易位（TET）蛋白，可启动DNA去甲基化，但尚不清楚5mC氧化是如何调节的。我们发现，蛋白SMCHD1（包含1的染色体柔性铰链结构域的结构维持）与TET蛋白复合物中发现，并负调控TET活性。从小鼠胚胎干细胞（ES）中去除SMCHD1可诱导DNA低甲基化，优先在SMCHD1-靶位点和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的积累，以及启动子去甲基化和激活杜克斯双同源异型盒基因。在缺乏SMCHD1的情况下，ES细胞获得双细胞（2c）胚胎样状态，其特征是早期胚胎转录组的激活，这主要是由杜克斯使用Smchd1号机组/测试1/测试2/测试3四重敲除细胞，我们发现DNA去甲基化杜克斯SMCHD1缺失的其他基因依赖于TET蛋白。这些数据确定SMCHD1是ES细胞2c样状态和TET介导的DNA去甲基化的拮抗剂。

PubMed免责声明

数字

**图1。SMCHD1和TET蛋白的相互作用。**
(A类)293T细胞TET3FL和TET3S的标记纯化。纯化后的样品进行考马斯蓝染色（左）和免疫印迹（右）。用MS.M、分子量标记分析所示凝胶片段；IB，免疫印迹。(B类)MS鉴定SMCHD1为TET3的结合伙伴。TET3S在293T细胞中表达，并用抗FLAG珠免疫沉淀。对凝胶段2（A）进行LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）分析（见材料和方法以及表S1）。显示了前八个最高核蛋白。分子量M.W。(C类)SMCHD1与TET1、TET2和TET3FL的内源性共免疫沉淀（co-IP）。(D类)利用293T细胞中标记蛋白的表达，通过co-IP实现TET蛋白和SMCHD1之间的相互作用。(E类)将TET3的不同结构域与全长SMCHD1共转染到293T细胞中。IP后，通过Western blotting鉴定相互作用蛋白。星号表示IgG（免疫球蛋白G）带。氨基酸。(F类)将SMCHD1的不同结构域与TET3FL共转染到293T细胞中。IP后，通过Western blotting鉴定相互作用蛋白。星星表示IgG带。HATPase，组氨酸激酶样ATP酶结构域。

**图2。SMCHD1抑制TET活性。**
(A类)293T细胞中SMCHD1与TET3共表达降低5hmC水平。使用基于抗体的斑点印迹法评估5hmC和5mC含量。进行单因素方差分析（ANOVA），将各组的平均值与第二组的平均值进行比较(***P（P）*<0.01和****P（P）*< 0.001; 平均值±SEM）。ns，不显著。(B类)通过SMCHD1抑制TET3S诱导293T细胞中甲基化荧光素酶结构的重新激活（上图）。进行单向方差分析(***P（P）*<0.01和*****P（P）*< 0.0001). 数据用于三个独立实验的平均值±SEM。使用未甲基化的萤光素酶载体作为对照（底部）。(C类)从Sf9昆虫细胞中提取TET2-CD和SMCHD1全长（SMCHD1-FL）的FLAG纯化。考马斯蓝染色。(D类)联合亚硫酸氢盐限制分析（COBRA）检测显示，在SMCHD1存在下，TET2-CD活性对完全甲基化DNA的抑制（BstU I裂解表明甲基化）。P.C.，过量TET蛋白阳性对照（18μg）；N.C.，阴性对照，未经TET治疗。显示了SMCHD1和TET蛋白（1.15μg）的不同摩尔比。这个*H19型*分析了压印控制区。(E类)亚硫酸氢盐序列分析*H19型*甲基化分析重复。实心黑色圆圈表示修改后的CpG；空心圆圈表示TET氧化的mCpG。紫色箭头表示BstU I站点。(F类)不同样本的修饰胞嘧啶（%Me）百分比。*P（P）*数值通过费希尔精确检验（双侧）确定。

**图3。在缺乏SMCHD1的情况下转录激活和2c样基因签名。**
(A类)三个CRISPR-Cas9 KO ES细胞克隆中缺少SMCHD1蛋白。(B类)RNA-seq数据的热图显示WT之间差异表达的基因(n个=3个克隆）和SMCHD1 KO(n个=3个克隆）ES细胞。(C类)2c类ES细胞特征的基因集富集分析（GSEA）。基因集表示2c小鼠胚胎中合子基因组激活期间激活的基因，并在2c:：番茄中富集⁺单元格(42)。这个x个轴显示日志₂KO/WT标记转录组的折叠变化。GSEA分析如前所述(49)。(D类)heatmap表明WT之间差异表达的2c类基因(n个=6）和SMCHD1 KO(n个=6）ES细胞，包括每个克隆的两个技术复制。典型的2c类基因，例如*杜克斯*（用红色箭头表示），*Z扫描4c*,*杜比1*、和*使用17l*指示家庭成员（由紫色箭头指示）。(E类)密度图显示SMCHD1 KO细胞中重复元件的激活。这个x个轴显示日志₂重复元素表达式的（KO/WT的折叠变化）。这个年轴表示密度。

**图4。SMCHD1缺失导致*杜克斯*和*Zscan4公司*基因簇，导致2c样细胞的出现。**
(A类)所有RNA-seq轨迹峰值的综合基因组查看器截图*Zscan4公司*WT和SMCHD1 KO ES细胞中的家族成员。(B类)SMCHD1 KO细胞株中ZSCAN4蛋白的上调。(C类)在缺乏SMCHD1的情况下，ES细胞群中ZSCAN4阳性细胞的比例增加。对ES细胞进行ZSCAN4（绿色）免疫染色。DNA用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）（蓝色）复染。比例尺，50μm。(D类)ZSCAN4的分数⁺WT ES细胞中的细胞和*Smchd1号机组*-KO ES细胞。t吨进行了统计分析测试(*P（P）*< 0.001). 误差条表示SEM（六个独立实验）。(E类)RNA-seq轨迹的浏览器视图*杜克斯*WT和SMCHD1 KO ES细胞中的基因座。这个*杜克斯*基因本身被涂成黄色。(F类)定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）数据证实*杜克斯*SMCHD1丢失时激活。β-肌动蛋白作为对照。进行单因素方差分析进行统计分析，将各组的平均值与WT组的平均值进行比较(****P（P）*< 0.001). 数据为三个独立KO克隆的平均值±SEM。

**图5。SMCHD1的缺失导致在*杜克斯*轨迹。**
(A类)WT和SMCHD1 KO样品在*杜克斯*基因座，由WGBS测定。差异甲基化区域以紫色阴影显示。CpG用勾号表示。红圈，WT；蓝色圆圈，SMCHD1 KO。圆圈大小与覆盖范围成正比。为每个样本显示一条平滑线。(B类)手动亚硫酸氢排序*杜克斯*WT和SMCHD1 KO细胞中的启动子。实心黑色圆圈表示修饰的CpG位点；开圆圈表示未修改的CpG位点。显示了修饰胞嘧啶（%Me）的总百分比。引物也如（A）所示。(C类)2C:：td番茄的代表性荧光图像和FACS图⁺中的单元格*Smchd1号机组*KO ES细胞群。(D类)甲基化*杜克斯*dTomato表达中的启动子（FACS分类）*Smchd1号机组*KO细胞数量进一步减少。数据显示亚硫酸氢盐序列分析*杜克斯*报告表达WT和SMCHD1 KO ES细胞中的启动子。显示了修饰胞嘧啶（%Me）的总百分比。(E类)改性胞嘧啶在*杜克斯*启动子由（B）和（D）确定。进行单向方差分析(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*<0.01****P（P）*<0.001，以及*****P（P）*<0.0001）。误差条表示来自三个重复克隆（WT和*Smchd1号机组*-KO）或重复样品（FACS分类2c-*Smchd1号机组*-KO电池）。

**图6。在缺乏SMCHD1的情况下，2c类转录组部分依赖于*杜克斯*.**
(A类)小引导RNA（gRNA）靶向区域位于*杜克斯*基因。桑格测序证实了移码突变。gRNA靶向的序列为蓝色，PAM（原间隔区相邻基序）序列为红色。每个克隆均显示双等位基因移码突变。将gRNA应用于WT和SMCHD1 KO ES细胞，以获得*杜克斯*单淘汰赛和*Smchd1/Dux公司*双敲除ES细胞克隆。(B类)热图显示了两种基因之间差异表达的2c类基因*杜克斯*/*Smchd1号机组*双淘汰赛(n个=3个克隆）和*Smchd1号机组*单一淘汰赛(n个=3个克隆，每个重复两次）ES细胞。蓝色表示基因在双基因敲除中不再上调。(C类)饼图显示，在136个单一KO上调的2c类基因中，有47个在缺乏*杜克斯*在中*Smchd1号机组*/*杜克斯*双KO。(D类)GVIZ程序包生成的RNA-seq轨迹*Z扫描4*WT ES细胞中的基因家族成员（黑色），*Smchd1号机组*KO ES细胞（红色），*杜克斯*KO ES电池（蓝色），以及*Smchd1号机组*加*杜克斯*（双KO）ES细胞（绿色）。

**图7。在没有SMCHD1的情况下，异常转录组和DNA低甲基化取决于TET蛋白的存在。**
(A类)三个靶向CRISPR-Cas9中SMCHD1蛋白缺失泰特三敲除ES细胞克隆。(B类)RNA-seq轨迹跨越*杜克斯*在WT中，泰特三敲除ES细胞，以及泰特-*Smchd1号机组*四个KO细胞。(C类)定量RT-PCR分析*杜克斯*以WT表示，泰特三次击倒和泰特-*Smchd1号机组*四敲除细胞。进行单因素方差分析。数据用于三个独立克隆的平均值±SEM。(D类)WT中不同基因的RNA-seq分析，*Smchd1号机组*让开，*杜克斯*让开，*第1页*和*杜克斯*（双）KO，太特三次击倒，以及*Tet-Smchd1测试*四敲除ES细胞。进行单因素方差分析，比较各组的平均值(n个=每个克隆3个）*Smchd1号机组*-KO集团(***P（P）*<0.01和*****P（P）*< 0.0001). 误差条表示SEM(E类)在缺乏TET蛋白的情况下，上调的2c类基因数量减少。(F类)亚硫酸氢盐序列分析*杜克斯*启动子泰特-TKO细胞和四敲除细胞。显示了修饰胞嘧啶（%Me）的百分比。(**G公司**)SMCHD1单个KO中的89%（75%和14%）显著上调的基因不再在TET蛋白缺失的情况下上调泰特-*Smchd1号机组*四-KO（qKO）细胞。(**H（H）**)SMCHD1作为TET蛋白负调控因子的模型*杜克斯*发起人。黑色圆圈，5mC；浅蓝色圆圈，5hmC；白色圆圈，非甲基化CpG。

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