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。2021年1月12日；16(1):106-119.
doi:10.1016/j.stemcr.2020.12.002。 Epub 2020年12月30日。

维持多功能乳腺干细胞需要AP-2γ

薇薇安·W·古 1, 爱德华·赵 2, 达科塔·T·汤普森 2, 维多利亚·C·卡萨迪 2, 尼古拉斯·博尔切丁 三, 凯尔西·E·科赫 2, 文森特·吴 2, Allison W Lorenzen公司 2, 达娜·范德海德 2, 杰弗里·怀特 2, 米哈伊尔·库拉克 2, 威廉姆斯 4, 张伟洲 5, 罗纳德·魏格尔（Ronald J Weigel） 6
附属公司

维持多功能乳腺干细胞需要AP-2γ

薇薇安·W·古等。 干细胞报告。 。

摘要

乳腺导管的形态发生依赖于乳腺干细胞分化为基底和管腔谱系。由Tfap2c编码的AP-2γ转录因子在乳腺发育中起着重要作用，但其在乳腺谱系，特别是MaSC中的作用尚不清楚。在这里，我们利用Tfap2c的诱导性条件敲除来阐明AP-2γ在MaSC维持和分化中的作用。基底上皮中AP-2γ的缺失深刻地改变了转录体，并减少了几个乳腺上皮细胞簇内的细胞数量，包括成年MaSC和管腔祖细胞。AP-2γ调节乳腺发育所需基因的表达，包括Cebpb、Nfkbia和Rspo1。因此，AP-2γ缺陷小鼠的乳腺导管生长受到抑制，再生能力受到抑制。研究结果表明，AP-2γ可以调节乳腺结构的发育，潜在地调节多能干细胞的维持和分化。

关键词：AP-2γ；Tfap2c；发展；乳腺。

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数字

图1
图1
AP-2γ缺失抑制乳腺导管生长（A）Krt5（Krt5）启动子用于驱动Cre公司重组酶通过Lox位点消除AP-2γ的表达，Lox位点设计用于去除Tfap2c型基因。（B） 自由现金流/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5 Cre急诊室T2段用玉米油（CO）或4-羟基-三苯氧胺（4OHT）和Cre公司免疫组化检测其表达；4OHT诱导的核CRE表达治疗。（C） 示意图显示了从4周龄开始用CO或4OHT治疗小鼠5天；在6周、9周、12周和16周时进行分析。（D） 蛋白质表达和总量分析。免疫组织化学（左侧）检测CKO的MMEC中AP-2γ蛋白的丢失Tfap2c型KRT5和KRT8的表达分别显示基底和管腔MMEC。在6周、9周和12周时，（BC）室中的AP-2γ表达显著降低。在6周时，发现肠壁细胞的AP-2γ表达显著降低，但在9周和12周时，这种降低并未持续。对每只动物至少三个具有代表性的显微镜视野（40倍放大）进行量化。通过比较染色细胞和总上皮细胞来计算百分比。结果表示为平均值±SEM;CO/4OHT数：n=5/5（6周），n=4/5（9周），n=4/4（12周），n=4/5（16周）。∗p<0.05，∗∗p<0.01；n.s.，不重要；Mann-Whitney U检验的统计显著性。6周、9周、12周和16周龄小鼠的代表性完整乳腺（右侧）；黑色箭头表示测量的距离。相应的图表显示了从淋巴结到最远的乳腺分支测量的乳腺树的生长，表明CKO为Tfap2c型，在16周内解决。结果表示为平均值±SEM；CO/4OHT小鼠数量：n=4/5（6周），n=5/5（9周），n=8/9（12周），n=14/14（16周）；∗p<0.05，∗∗p<0.01；n.s.，不重要；Mann-Whitney U检验的统计显著性。
图2
图2
scRNA-Seq分析（A）实验在两个独立的重复中进行，在每个实验中，使用两个CO和两个4OHT处理的小鼠进行乳腺收获，每个条件下共有n=4只小鼠。UMAP聚类分析鉴定出13个乳腺细胞簇；转录组定义了密切相关的簇，包括BC、管腔前体簇（LPC）、成熟管腔簇（LMC）和Procr公司+干细胞簇（PSC）。（B） 用于分类乳腺细胞簇主要组的基因表达示例。（C） 分别显示CO处理（橙色）和4OHT处理（茶色）动物的UMAP簇。（D） CO和4OHT处理的动物每簇中乳腺细胞的相对比例，其中0.50表示细胞的相对数量没有变化；∗p<0.05。（E） CO和4OHT处理小鼠的细胞频率由集群中细胞的相对数量显示。（F） 的表达式模式Tfap2c型CO和4OHT处理的小鼠。
图3
图3
CKO引起的基因表达变化Tfap2c型（A） 垂直轴显示−log的火山图10随着AP-2γ的损失，所有MMEC中改变的基因的p值和横轴平均对数倍变化；彩色点代表p<0.05和平均对数变化>±0.5的基因；蓝色用于抑制基因，红色用于KO诱导的基因Tfap2c型（B）与（A）中所示相同的数据，用平均对数变化与显示基因表达的细胞百分比差异绘制。标记的基因具有调整后的p值<0.05和±5%的差异。（C） 簇4、8、10和11的基因表达变化的火山图，如（A）所示。
图4
图4
随着AP-2γ（A）细胞周期丢失，MaSCs的变化显示为G中细胞的比例1、S和G2/CO和4OHT处理小鼠的乳腺细胞簇M。（B） 的表达式模式伊特加6,Itgb1号机组,镉24a、和Lgr5级来自CO和4OHT处理小鼠的基因。中间面板：放大框状区域的视图，聚焦于基底簇4和10；右侧面板：显示相对表达式的热图伊特加6,Itgb1号机组,镉24a、和Lgr5级在CO和4OHT处理的小鼠的基础MMEC簇中。
图5
图5
AP-2γ缺失减少哺乳动物球和乳腺重建从9周龄FVB中采集的MMEC形成的哺乳动物球/Tfap2c型飞行/飞行/Krt5-Cre-ER公司T2段从4周开始用CO和4OHT治疗的小鼠。（A） 培养14天后的原始乳房样本。（B） 乳房球形成效率（MFE）和乳房球大小的数据；n=每种条件下重复12次4000个细胞的电镀；∗p<0.05；n.s.，不显著，学生t检验。（C） 由（A和B）中所述的初级乳房球形成的次级乳房球，以及MFE和尺寸数据；n=每种条件下重复12次4000个细胞的电镀∗p<0.05，∗∗p<0.01，学生t检验。（D） GFP示例+Ad5CMVeGFP转导MMEC中的乳房球培养14天，MFE转导Ad5CMVeGFP和Ad5CMVCre-eGFP；∗∗p<0.01，学生t检验。（E） 顶部面板显示了CO处理动物再造乳腺分支的示例；数据表明，移植来自经CO处理但未经4OHT处理的小鼠的乳腺组织，发现乳腺树重建，7/13与0/13，p<0.01，Fisher精确检验；填充百分比结果图为平均值±SEM，∗p＜0.05，Mann-Whitney U检验。（F） 顶部面板显示了Ad-GFP转导细胞的再造乳腺分支示例；数据显示，经Ad-GFP转导但未经Ad-Cre转导的细胞重建乳腺树，4/7对0/8，p<0.05，Fisher精确检验；填充率结果图为平均值±SEM；∗p<0.05，Mann-Whitney U检验。
图6
图6
假时间分析与乳腺细胞发育模型（A）基于scRNA-seq的假时间分析弹弓；第一个面板显示伪时间覆盖tSNE图，与前面的图具有相同的聚类，其余面板显示从中推断出的每个个体谱系弹弓（B）CKO结果支持的乳腺发育模型Tfap2c型；括号中的数字表示集群编号。
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