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.2020年11月21日；12(24):25845-25864.
doi:10.18632/aging.202147。 Epub 2020年11月21日。

长非编码RNA LINC01140/miR-140-5p/FGF9轴调节膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化

吴水清 1, 冉旭 1, 宣竺 1, 何海清 1, 张金华（Jinhua Zhang） 1, 齐曾 1, 王银怀 1, 赵晓坤 1
附属公司

长非编码RNA LINC01140/miR-140-5p/FGF9轴调节膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化

吴水清等。 老龄化（纽约州奥尔巴尼市）. .

摘要

肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）仅占膀胱癌的少数，然而，MIBC患者的疾病特异性和总体生存率较低。据报道，巨噬细胞M2极化与膀胱癌预后较差有关。通过癌症生物信息学和实验分析，发现FGF9在MIBC组织中上调。T24细胞中FGF9的敲低强烈抑制了细胞的生存能力、迁移能力和侵袭能力；用FGF9击倒T24细胞（si-FGF9-CM）培养基培养可显著抑制巨噬细胞M2极化，同时促进M1极化。长非编码RNA（lncRNA）LINC01140与FGF9呈正相关，在MIBC组织中显著上调。LINC01140基因敲除抑制T24细胞的活性、迁移能力和侵袭能力；si-LINC01140-CM中的培养物也抑制巨噬细胞M2极化，同时促进M1极化。LINC01140靶向miR-140-5p，而miR-140-5p靶向FGF9以形成lncRNA-miRNA-mRNA轴。miR-140-5p抑制对膀胱癌侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响与LINC01140或FGF9敲除的作用相反；此外，miR-140-5p抑制部分逆转了LINC01140敲低对FGF9蛋白水平、膀胱癌表型和巨噬细胞M2极化的影响。总之，LINC01140、miR-140-5p和FGF9形成一个lncRNA-miRNA-mRNA轴，调节膀胱癌表型，通过肿瘤微环境影响巨噬细胞M2极化，进而影响膀胱癌细胞的侵袭性。

关键词：FGF9；肌肉浸润性膀胱癌；长非编码RNA LINC01140；巨噬细胞M2极化；miR-140-5p。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：这些作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
FGF9在肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）和非肌肉浸润性前列腺癌（NMIBC）组织中的表达。(一个)FGF9在MIBC和NMIBC组织中的表达基于来自GSE77952的数据。P（P）=0.007，学生T测试。(B类)采用log-rank检验，根据FGF9表达对样本进行分组，分析膀胱癌患者的总体生存率。数据基于TCGA数据库。(C类)H&E染色显示MIBC和NMIBC组织的病理变化。(D类)采用实时荧光定量PCR检测12例MIBC和12例NMIBC组织中FGF9的表达。P（P）<0.01，配对学生T检验。(E类)采用免疫印迹法检测12例MIBC和12例NMIBC组织中FGF9的蛋白水平。P（P）<0.01，配对学生T检验。(F类)采用免疫荧光（IF）染色法测定CD163（M2巨噬细胞标记物）在MIBC和NMIBC组织中的蛋白分布。
图2
图2
FGF9对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响。(一个)通过转染si-FGF9，在T24膀胱癌细胞系中产生FGF9敲除。实时PCR验证了转染效率。P（P）<0.01，学生T测试。接下来，用si-FGF9转染T24细胞并检测其(B类)MTT法检测细胞活力**P（P）<0.01，单因素方差分析。(C类)伤口愈合试验的迁移能力；P（P）<0.05，学生T检验。(D类)Transwell分析的侵入能力，P（P）<0.05，学生T检验。；和(E类)免疫印迹法检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9的蛋白水平**P（P）<0.01，学生T测试。(F类)从外周血（PBMC）中分离单核细胞，并用50ng/ml M-CSF处理以刺激单核细胞分化为巨噬细胞（M0）。流式细胞术鉴定M0巨噬细胞为CD11b阳性。(G公司)然后用20 ng/ml IL-4（eBioscience）刺激M0巨噬细胞两天，诱导M2极化，并用抗CD11b和抗CD206抗体进行IF染色验证。花序强度如右图所示。P（P）<0.01，学生T测试。(H（H）–K（K）)接下来，用si-FGF9或si-NC（阴性对照）转染T24细胞，收集培养基（如图所示为条件培养基、si-NC-CM和si-FGF9-CM）进行巨噬细胞培养。将M0巨噬细胞分为四组：IL-4（M2极化诱导）+si-NC-CM、IL-4（M2极化诱导）+si-FGF9-CM、LPS+IFNγ（M1极化诱导(H（H）)免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平。P（P）<0.05或P（P）<0.01，学生T检验。；(我)流式细胞术检测CD206和CD16阳性细胞百分率；(J型)用IF染色法测定CD206和CD16的花序强度。花序强度如右图所示。P（P）<0.01，学生T检验。(K（K）)用ELISA法测定培养液中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度**P（P）<0.01，学生T测试。
图3
图3
lncRNA LINC01140在NMIBC和MIBC组织中的表达。(一个)根据GSE77952的数据，研究lncRNA LINC01140在MIBC和NMIBC组织中的表达。P（P）=0.0295，学生T检验。(B类)采用log-rank检验，根据LINC01140的表达对样本进行分组，分析膀胱癌患者的总体生存率。数据基于TCGA数据库。(C类)采用实时荧光定量PCR技术检测了12例MIBC和12例NMIBC组织中LINC01140的表达。P（P）<0.01，配对学生T检验。(D类)采用Pearson相关分析法分析组织样本中LINC01140和FGF9表达之间的相关性**P（P）<0.01.
图4
图4
LINC01140对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响。(一个)通过si-LINC01140转染在T24膀胱癌细胞系中产生LINC01140敲除。通过实时PCR验证转染效率(P（P）<0.01，学生T测试）。接下来，用si-LINC01140转染T24细胞并检测其(B类)MTT法测定细胞活力**P（P）<0.01，单因素方差分析。；(C类)通过伤口愈合试验测定迁移能力，P（P）<0.05，学生T检验；(D类)Transwell分析的侵入能力，P（P）<0.05，学生T检验；和(E类)免疫印迹法检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9的蛋白水平，P（P）<0.01，学生T测试。用si-LINC01140或si-NC（阴性对照）转染T24细胞，收集培养基（如图所示为条件培养基、si-NC-CM和si-LINC01140-CM）进行巨噬细胞培养。用50 ng/ml M-CSF处理单核细胞，以刺激单核细胞分化为M0巨噬细胞。M0巨噬细胞分为四组：IL-4（M2极化诱导）+si-NC-CM、IL-4（M2极化诱导）+si-LINC0140-CM、LPS+IFNγ（M1极化诱导(F类)免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平，P（P）<0.01，学生T检验；(G公司)流式细胞术检测CD206和CD16阳性细胞百分率；(H（H）)用IF染色法测定CD206和CD16的花序强度，右侧为花序强度。P（P）<0.01，学生T测试。(我)通过ELISA测定巨噬细胞培养基中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度**P（P）<0.01，学生T测试。
图5
图5
miR-140-5p直接作用于LINC01140和FGF9 3'UTR。(一个)在线工具mirDIP、TargetScan、starBase V3、microT-CDS、miRDB和LncTar预测并选择可能同时靶向LINC01140和FGF9 3'UTR的miRNAs。选择了两个miRNAs，miR-140-5p和miR-580-3p。(B类)通过实时PCR测定miR-140-5p和miR-580-3p在SV-HUC-1和T24细胞中的表达。P（P）<0.01，学生T测试。(C类)通过转染miR-140-5p或抗miR-140-5 p，miR-140-50p在T24细胞中过度表达或被抑制。实时PCR验证了转染效率。P（P）<0.01，单向方差分析。(D类)用miR-140-5p或抗miR-140-5 p转染T24细胞，并通过免疫印迹法检测FGF9的蛋白水平，P（P）<0.01，单向方差分析测试。(E类,F类)如材料和方法部分所述，构建野生型和突变型LINC01140和FGF9 3'UTR荧光素酶报告载体。这些载体在293T细胞中与miR-140-5p或抗miR-140-5 p共转染。测定荧光素酶活性的变化。P（P）<0.01，单向方差分析测试**P（P）<0.01, #P（P）<0.05, ##P（P）<0.01.
图6
图6
LINC01140和miR-140-5p对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化T24细胞的动态影响与si-LINC01140及抗miR-140-5 p共转染，并检测其活性(一个)MTT法检测细胞活力；(B类)免疫印迹法检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白水平；(C类)伤口愈合试验的迁移能力；和(D类)Transwell分析的侵入能力。(E类,F类)用si-LINC01140和抗miR-140-5p共同转染T24细胞，收集培养基（如图所示，条件培养基（CM）si-NC+抗-NC、si-LINC01140+抗-NC、si-NC+抗-miR-140-5p和si-LINP01140+抗-miR 140-5p）进行巨噬细胞培养。在上述四种CMs中培养M0巨噬细胞，并分别极化为M1或M2，并检测其(E类)免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平。(F类)用ELISA法测定巨噬细胞培养液中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度*P（P）<0.05, **P（P）与对照组相比<0.01#P（P）<0.05, ##P（P）与si-NC+抗miR-140-5p组相比，<0.01。统计分析采用单因素方差分析。
图7
图7
拟议机构的示意图。LINC01140/miR-140-5p/FGF9轴通过肿瘤微环境调节膀胱癌表型并促进巨噬细胞M2极化。
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