The long noncoding RNA LINC01140/miR-140-5p/FGF9 axis modulates bladder cancer cell aggressiveness and macrophage M2 polarization

Shuiqing Wu; Ran Xu; Xuan Zhu; Haiqing He; Jinhua Zhang; Qi Zeng; Yinhuai Wang; Xiaokun Zhao

doi:10.18632/aging.202147

诺贝尔奖精选文章

伊丽莎白·布莱克本他是《老龄化》编辑委员会的成员，曾获得2009年诺贝尔生理学或医学奖，同时也是该委员会的成员。Elizabeth Blackburn合著了纸张发表在《老龄化》第一期（创刊）上。
安德鲁·沙利，诺贝尔奖获得者，发表了他的纸张老化。
山中信雅荣获2012年诺贝尔生理学和医学奖。Shinya Yamanaka合著了纸张发表在Aging上。

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研究论文第12卷第24期第25845-25864页

长非编码RNA LINC01140/miR-140-5p/FGF9轴调节膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化

吴水清^1, , 冉旭^1, , 宣竺^1, , 何海清^1, , 张金华（Jinhua Zhang）^1, , 齐增^1, , 王银怀^1, , 赵晓坤^1, ,

¹中华人民共和国湖南省长沙市中南大学湘雅第二医院泌尿科，410011

收到日期：2020年2月24日接受日期：2020年9月9日发布日期：2020年11月21日

https://doi.org/10.18632/aging.202147
如何引用

摘要

肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）仅占膀胱癌的少数，然而，MIBC患者的疾病特异性和总体生存率较低。据报道，巨噬细胞M2极化与膀胱癌预后较差有关。通过癌症生物信息学和实验分析，发现FGF9在MIBC组织中上调。T24细胞中FGF9的敲低强烈抑制了细胞的生存能力、迁移能力和侵袭能力；用FGF9击倒T24细胞（si-FGF9-CM）培养基培养可显著抑制巨噬细胞M2极化，同时促进M1极化。长非编码RNA（lncRNA）LINC01140与FGF9呈正相关，在MIBC组织中显著上调。LINC01140基因敲除抑制T24细胞的活性、迁移能力和侵袭能力；si-LINC01140-CM中的培养物也抑制巨噬细胞M2极化，同时促进M1极化。LINC01140靶向miR-140-5p，而miR-140.5p靶向FGF9形成lncRNA-miRNA-mRNA轴。miR-140-5p抑制对膀胱癌侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响与LINC01140或FGF9敲除的作用相反；此外，miR-140-5p抑制部分逆转了LINC01140敲低对FGF9蛋白水平、膀胱癌表型和巨噬细胞M2极化的影响。总之，LINC01140、miR-140-5p和FGF9形成一个lncRNA-miRNA-mRNA轴，调节膀胱癌表型，通过肿瘤微环境影响巨噬细胞M2极化，进而影响膀胱癌细胞的侵袭性。

介绍

膀胱癌是世界上最严重的恶性肿瘤之一[1]. 首次诊断时，近四分之三的膀胱癌患者被诊断为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC），而约四分之一的患者患有肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）[2,三]. 尽管MIBC仅占膀胱癌的少数，但通常认为MIBC患者的疾病特异性和总生存率较低[4,5]五年总生存率为30-50%[三]. 经尿道最大限度切除加放化疗是膀胱癌最常见的治疗策略[6]. 然而，MIBC被认为是一种高致死性疾病，需要新辅助治疗；因此，比较MIBC和NMIBC之间的差异可能为改进新辅助治疗提供一些策略。

肿瘤微环境（TME）是肿瘤周围的环境，由肿瘤细胞、基质和浸润免疫细胞组成。肿瘤微环境中的免疫细胞可能在抑制或促进癌症方面发挥作用[7]. CD8+T细胞和NK（自然杀伤细胞）都可以介导抗癌作用，而肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞则充当肿瘤促进剂[8,9]. 巨噬细胞是先天性和适应性免疫系统的关键参与者。巨噬细胞功能类型的最新分类包括具有促炎活性的经典活化（M1）巨噬细胞和具有抗炎功能的交替活化（M2）巨噬细胞[10]. 越来越多的证据表明M2巨噬细胞可以加速肿瘤的进展和转移[8,11,12]. 在膀胱癌中，M2或交替极化的巨噬细胞与预后较差相关[13]. 因此，推测M2巨噬细胞可能是MIBC治疗的免疫治疗靶点[12]. M2巨噬细胞对肿瘤进展和转移的加速作用是通过复杂的串扰机制介导的，癌细胞通过这种机制作用于肿瘤相关巨噬细胞，反之亦然。然而，膀胱癌细胞通过再教育常驻巨噬细胞来激发这种极化程序的确切机制仍不清楚。

在过去的几十年里，高通量生物特征识别技术已经应用于癌症研究，以确定能够促进发现和翻译的关键生物标记物[14,15]. 目前，我们可以进行先进的生物信息分析，以解决异常基因表达和关键信号通路，从而为膀胱癌的研究提供多种临床评估[16]. 据报道，成纤维细胞生长因子9（FGF9）可增强糖尿病梗死心脏M2巨噬细胞极化[17]而M2巨噬细胞是膀胱癌相关巨噬细胞的主要类型，可以加速膀胱癌的进展[18,19]. 在癌症中，FGF9过度表达会加速肺腺癌[20]. 值得注意的是，与NMIBC相比，GSE77952分析确定FGF9是MIBC中一个显著上调的基因；因此，研究FGF9对膀胱癌巨噬细胞M2极化的影响及其潜在机制，可以作为治疗MIBC的一种新策略。

随着高通量测序技术的发展，人们发现只有不到2%的转录物编码蛋白质，而其余转录物被转录为ncRNAs（非编码RNA），其中包括miRNAs和lncRNAs[21]. LncRNAs有助于染色质重塑、RNA衰变、表观遗传调控、染色质修饰和许多其他细胞功能[22,23]通过转录和转录后影响基因表达。这样，lncRNAs调节肿瘤的形成、侵袭和转移[24,25]. 值得注意的是，有报道称几种lncRNAs可调节癌症中巨噬细胞M2极化。LncRNA GAS5抑制调节M2巨噬细胞极化的关键因子TRF4的转录，从而抑制脱髓鞘疾病中的M2极化[26]. LncRNA KCNQ1OT1可以抑制miR-21a-5p，诱导巨噬细胞极化，从而改善颗粒诱导的骨溶解[27]. 在子宫内膜癌中，lncRNA NIFK-AS1通过靶向miR-146a抑制巨噬细胞M2极化[28]. 由于许多lncRNA在膀胱癌中被解除调控，我们假设lncRNA也可能调节巨噬细胞M2极化，从而影响膀胱癌细胞的侵袭性。此外，该机制可能与miRNAs有关。

在此，我们首先检测了MIBC和NMIBC组织样本中FGF9的表达和蛋白水平；此外，使用免疫荧光（IF）染色检测相同样本中M2标记CD163的蛋白质含量和分布。对FGF9进行敲除，测定FGF9敲除对膀胱癌细胞侵袭性的特异性影响以及FGF9击倒癌细胞培养液中培养的巨噬细胞M2极化。接下来，分析与FGF9相关的差异表达lncRNA，并选择LINC01140；确定了LINC01140在膀胱癌细胞的侵袭性和在癌细胞培养基中培养的巨噬细胞的M2极化中的作用。最后，我们分析了可能同时靶向LINC01140和FGF9的miRNAs，并选择miR-140-5p；测定了LINC01140和miR-140-5p对在癌细胞培养基中培养的巨噬细胞的FGF9表达、膀胱癌细胞侵袭性和M2极化的动态影响。总之，我们发现一个lncRNA-miRNA-mRNA轴调节巨噬细胞M2极化，从而影响膀胱癌细胞的侵袭性。

结果

FGF9在肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）和非肌肉浸润性前列腺癌（NMIBC）组织中的表达

为了确定MIBC发病的相关因素，我们分析了在线微阵列表达谱（GSE77952），报告了14例MIBC和16例NMIBC组织中差异表达的基因；在MIBC组织中，FGF9的表达明显上调（p=0.0070，图1A). 根据TCGA数据，FGF9的高表达与膀胱癌患者的总体生存率较差相关（危险比=1.900（95%CI=1.079-3.345），logrank P=0.0213，图1B). 因此，选择FGF9进行进一步实验。

图1。 FGF9在肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）和非肌肉浸润性前列腺癌（NMIBC）组织中的表达。(一个)根据GSE77952的数据，研究FGF9在MIBC和NMIBC组织中的表达。对=0.007，学生T测试。(B类)采用log-rank检验，根据FGF9表达对样本进行分组，分析膀胱癌患者的总体生存率。数据基于TCGA数据库。(C类)H&E染色显示MIBC和NMIBC组织的病理变化。(D类)采用实时荧光定量PCR检测12例MIBC和12例NMIBC组织中FGF9的表达。对<0.01，配对学生T检验。(E类)采用免疫印迹法检测12例MIBC和12例NMIBC组织中FGF9的蛋白水平。对<0.01，配对学生T检验。(F类)采用免疫荧光（IF）染色法测定CD163（M2巨噬细胞标记物）在MIBC和NMIBC组织中的蛋白分布。

接下来，我们收集了12个MIBC和NMIBC组织，H&E染色结果如所示图1C然后，采用实时荧光定量PCR检测12例MIBC和12例NMIBC组织中FGF9的表达。与在线数据一致，与NMIBC组织样本相比，MIBC组织样本中FGF9的表达显著上调(图1D). 免疫印迹分析表明，与NMIBC组织样品相比，MIBC组织样品中FGF9蛋白含量增加(图1E). 采用免疫荧光（IF）染色法测定MIBC和NMIBC组织中CD163（M2巨噬细胞标志物）的蛋白含量和分布；值得注意的是，结果显示在MIBC样本中CD163阳性细胞更常见(图1F). 这些数据表明FGF9在膀胱癌中过度表达，尤其是在MIBC中。此外，M2巨噬细胞在MIBC中占巨噬细胞的更大比例。因此，我们推测FGF9可能通过促进巨噬细胞M2极化来促进膀胱癌的发展。

FGF9对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响

为了验证这一假设，我们将si-FGF9转染到T24细胞中，以产生FGF9击倒T24膀胱癌细胞，并进行实时PCR(图2A)和免疫印迹(图2E)验证转染效率。在击倒T24细胞中的FGF9后，细胞活力、迁移能力和侵袭能力均被显著抑制(图2B-D） ●●●●。我们进一步证实，增殖标记物ki-67和细胞外基质标记物MMP-2和MMP-9的蛋白水平也显著降低(图2E). 因此，击倒FGF9可显著抑制膀胱癌细胞的侵袭性。

图2。 FGF9对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响。(一个)通过转染si-FGF9，在T24膀胱癌细胞系中产生FGF9敲除。实时PCR验证了转染效率。对<0.01，学生T测试。接下来，用si-FGF9转染T24细胞并检测其(B类)MTT法检测细胞活力**对<0.01，单因素方差分析。(C类)伤口愈合试验的迁移能力；对<0.05，学生T检验。(D类)Transwell分析的侵入能力，对<0.05，学生T检验。；和(E类)免疫印迹法检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9的蛋白水平**对<0.01，学生T检验。(F类)从外周血（PBMC）分离单核细胞，并用50 ng/ml M-CSF处理，以刺激单核细胞分化为巨噬细胞（M0）。通过流式细胞术鉴定M0巨噬细胞为CD11b阳性。(G公司)然后用20 ng/ml IL-4（eBioscience）刺激M0巨噬细胞两天，诱导M2极化，并用抗CD11b和抗CD206抗体进行IF染色验证。花序强度如右图所示。对<0.01，学生T测试。(H（H）–K（K）)接下来，用si-FGF9或si-NC（阴性对照）转染T24细胞，收集培养基（如图所示为条件培养基、si-NC-CM和si-FGF9-CM）进行巨噬细胞培养。将M0巨噬细胞分为四组：IL-4（M2极化诱导）+si-NC-CM、IL-4（M2极化诱导）+si-FGF9-CM、LPS+IFNγ（M1极化诱导(H（H）)免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平。对<0.05或对<0.01，学生T检验。；(我)流式细胞术检测CD206和CD16阳性细胞百分率；(J型)用IF染色法测定CD206和CD16的花序强度。花序强度如右图所示。对<0.01，学生T测试。(K（K）)用ELISA法测定培养液中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度**对<0.01，学生T测试。

为了验证FGF9对膀胱癌巨噬细胞M2极化的影响，我们从外周血中分离单核细胞（PBMC），并用50 ng/ml M-CSF刺激单核细胞进行极化诱导。流式细胞术鉴定巨噬细胞为CD11b阳性(图2F). 通过IF鉴定极化M2巨噬细胞的CD11b和CD206表达。结果表明，M2极化后CD206表达的花序强度显著增加(图2G). 接下来，用si-FGF9或si-NC（阴性对照）转染T24细胞，并收集培养基（图中显示为条件培养基si-NC-CM和si-FGF9-CM）用于巨噬细胞孵育。将M0巨噬细胞分为四组：IL-4（M2极化诱导）+si-NC-CM、IL-4（M2极化诱导）+si-FGF9-CM、LPS+IFNγ（M1极化诱导。在M2极化条件下，用si-FGF9-CM培养可显著降低M2巨噬细胞标记CD206的蛋白水平，同时增加M1巨噬细胞标记物CD16的蛋白水平(图2H). 此外，流式细胞仪结果和IF结果进一步证实，si-FGF9-CM降低了CD206阳性细胞的百分比和CD206荧光强度，同时增加了CD16阳性细胞的比例和CD16荧光强度(图2I,2J型). ELISA还显示，在si-FGF9-CM处理的细胞中，M2标记物IL-10和Arg1的浓度增加，而在si-FGF9-CM处理细胞中，M1标记物iNOS和TNF-α的浓度降低(图2K). 这些数据表明，膀胱癌细胞中FGF9的敲除可以通过肿瘤微环境减弱巨噬细胞M2极化。

lncRNA LINC01140在NMIBC和MIBC组织中的表达

考虑到lncRNAs对巨噬细胞极化和致癌作用至关重要[29–31]接下来，我们分析了GSE77952，以确定可能与MIBC发展相关的差异表达lncRNA。通过分析FGF9和差异表达的lncRNA之间的相关性，研究表明lncRNA LINC01140的表达与FGF9显著相关（数据未显示），并且在MIBC组织中上调（p=0.0295，图3A). 此外，根据TCGA数据，FGF9的高表达也与膀胱癌患者的总体生存率较差有关（危险比=3.168（95%可信区间=1.750-5.735），logrank P=2.355e-05，图3B).

图3。 lncRNA LINC01140在NMIBC和MIBC组织中的表达。(一个)根据GSE77952的数据，研究lncRNA LINC01140在MIBC和NMIBC组织中的表达。对=0.0295，学生T测试。(B类)采用log-rank检验，根据LINC01140的表达对样本进行分组，分析膀胱癌患者的总体生存率。数据基于TCGA数据库。(C类)采用实时荧光定量PCR技术检测了12例MIBC和12例NMIBC组织中LINC01140的表达。对<0.01，配对学生T检验。(D类)采用Pearson相关分析法分析组织样本中LINC01140和FGF9表达之间的相关性**对<0.01.

其次，采用实时荧光定量PCR检测12例MIBC和12例NMIBC组织中LINC01140的表达；与FGF9类似，与NMIBC组织样本相比，MIBC组织样本中LINC01140的表达显著上调(图3C). 在组织样本中，LINC01140和FGF9的表达呈正相关(图3D).

LINC01140对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响

为了验证LINC01140对膀胱癌细胞侵袭性和MIBC发展的特异性作用，我们转染si-LINC01140，在T24细胞中产生LINC01140-敲除，并进行实时PCR验证转染效率(图4A). 与FGF9敲除类似，LINC01140敲除显著抑制T24细胞活性、迁移和侵袭性(图4B–4D（四维）). 通过LINC01140敲除，FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9的蛋白水平也明显降低(图4E).

图4。 LINC01140对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响。(一个)通过si-LINC01140转染在T24膀胱癌细胞系中产生LINC01140敲除。通过实时PCR验证转染效率(对<0.01，学生T测试）。接下来，用si-LINC01140转染T24细胞并检测其(B类)MTT法测定细胞活力**对<0.01，单因素方差分析。；(C类)通过伤口愈合试验测定迁移能力，对<0.05，学生T检验；(D类)Transwell分析的侵入能力，对<0.05，学生T检验；和(E类)通过免疫印迹检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9的蛋白水平，对<0.01，学生T测试。用si-LINC01140或si-NC（阴性对照）转染T24细胞，并收集培养基（图中显示为条件培养基、si-NC-CM和si-LINC01140-CM）用于巨噬细胞孵育。用50 ng/ml M-CSF处理单核细胞，以刺激单核细胞分化为M0巨噬细胞。M0巨噬细胞分为四组：IL-4（M2极化诱导）+si-NC-CM、IL-4（M2极化诱导）+si-LINC0140-CM、LPS+IFNγ（M1极化诱导(F类)免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平，对<0.01，学生T检验；(G公司)流式细胞术检测CD206和CD16阳性细胞百分率；(H（H）)用IF染色法测定CD206和CD16的花序强度，右侧为花序强度。对<0.01，学生T测试。(我)用ELISA法测定巨噬细胞培养液中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度**对<0.01，学生T测试。

接下来，类似地，用si-LINC01140或si-NC（阴性对照）转染T24细胞，收集培养基（如图中所示为条件培养基si-NC-CM和si-LINC01140-CM）进行巨噬细胞培养。将M0巨噬细胞分为四组：IL-4（M2极化诱导）+si-NC-CM、IL-4（M2极化诱导）+si-LINC0140-CM、LPS+IFNγ（M1极化诱导。在M2极化条件下，用si-LINC01140-CM培养可显著降低M2标记CD206的蛋白水平，同时增加巨噬细胞中M1标记CD16的蛋白水平(图4F). 此外，流式细胞仪结果和IF结果进一步证实，si-LINC01140-CM降低了CD206阳性细胞和CD206荧光强度的百分比，同时增加了CD16阳性率和CD16荧光强度的比例(图4G和图4H). 此外，在si-LINC01140-CM处理的细胞中，M2标记物IL-10和Arg1的浓度显著降低，而M1标记物iNOS和TNF-α的浓度升高(图4G). 这些数据表明，LINC01140也可能作为膀胱癌的癌基因，可能通过影响膀胱癌细胞的侵袭性和巨噬细胞M2极化。

miR-140-5p直接靶向FGF9的LINC01140和3'UTR

由于lncRNAs可以通过其MRE（miRNA反应元件）竞争性靶向miRNAs，作为ceRNAs（竞争性内源性RNAs），从而调节下游靶RNA的表达[40]在此，我们假设miRNAs可能参与LINC01140和FGF9对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化的影响。我们使用了六种在线工具（mirDIP、TargetScan、starBase V3、microT-CDS、miRDB和LncTar）来识别可能同时针对LINC01140和FGF9 3'UTR的miRNAs；我们选择了两个miRNAs，miR-140-5p和miR-580-3p(图5A). 接下来，我们进行实时PCR以检测miR-140-5p和miR-580-3p在T24细胞和正常人膀胱上皮细胞系SV-HUC-1中的表达；T24细胞中miR-140-5p的表达显著下调，而miR-580-3p的表达无明显变化(图5B). 因此，我们选择miR-140-5p进行进一步实验。

miR-140-5p直接作用于LINC01140和FGF9 3'UTR。（A）在线工具mirDIP、TargetScan、starBase V3、microT-CDS、miRDB和LncTar预测并选择可能同时靶向LINC01140和FGF9 3'UTR的miRNAs。选择了两个miRNAs，miR-140-5p和miR-580-3p。（B）通过实时PCR检测SV-HUC-1和T24细胞中miR-140-5p和miR-580-3p的表达。PC）通过转染miR-140-5p或抗miR-140-5 p，在T24细胞中miR-140-50p过度表达或被抑制。实时PCR验证了转染效率。PD）T24细胞转染miR-140-5p或抗miR-140-5 p，并通过免疫印迹法检测FGF9的蛋白水平，PE，F）构建野生型和突变型LINC01140和FGF9 3'UTR荧光素酶报告载体，如材料和方法部分所述。这些载体在293T细胞中与miR-140-5p或抗miR-140-5 p共转染。测定荧光素酶活性的变化。PPPP（聚丙烯）

图5。 miR-140-5p直接作用于LINC01140和FGF9 3'UTR。(一个)在线工具mirDIP、TargetScan、starBase V3、microT-CDS、miRDB和LncTar预测并选择可能同时靶向LINC01140和FGF9 3'UTR的miRNAs。选择了两种miRNA，miR-140-5p和miR-580-3p。(B类)通过实时PCR检测SV-HUC-1和T24细胞中miR-140-5p和miR-580-3p的表达。对<0.01，学生T检验。(C类)通过转染miR-140-5p或抗miR-140-5 p，miR-140-50p在T24细胞中过度表达或被抑制。实时PCR验证了转染效率。对<0.01，单向方差分析测试。(D类)用miR-140-5p或抗miR-140-5 p转染T24细胞，并通过免疫印迹法检测FGF9的蛋白水平，对<0.01，单向方差分析。(E类,F类)如材料和方法部分所述，构建野生型和突变型LINC01140和FGF9 3'UTR荧光素酶报告载体。这些载体在293T细胞中与miR-140-5p或抗miR-140-5 p共转染。测定荧光素酶活性的变化。对<0.01，单向方差分析测试**对<0.01, #对<0.05, ##对<0.01.

为了研究miR-140-5p的特异性作用，我们转染了miR-140-5 p/抗-miR-140-5p，使其在T24细胞中过度表达或抑制miR-140-5b，并进行实时PCR以验证转染效率(图5C). 在T24细胞中，miR-140-5p的过度表达显著降低了FGF9蛋白水平，而miR-140-5的抑制增加了FGF8蛋白水平(图5D). 为了进一步证实miR-140-5p与LINC01140和FGF9的相关性，我们测量了miR-140-5p对LINC01140-FGF9敲除的反应水平。如所示补充图2A，LINC01140的敲除增加了miR-140-5p的水平，而FGF9的敲除不影响miR-140-5 p的水平(补充图2B).

为了验证miR-140-5p与LINC01140和FGF9 3'UTR的预测结合，进行了荧光素酶报告分析。基于材料和方法部分，我们构建了两种不同类型的LINC01140和FGF9 3'UTR荧光素酶报告载体，野生型和突变型。其次，我们在293T细胞中用miR-140-5p/抗-miR-140-5p共同转染这些载体。图5E,5楼显示野生型LINC01140和FGF9 3’UTR载体萤光素酶活性被miR-140-5p的过表达明显抑制，但被miR-140-5p的抑制增强。此外，突变假定的miR-140-5p结合位点消除了荧光素酶活性的变化。这些数据表明，LINC01140和FGF9 3'UTR是miR-140-5p的直接下游靶点。

LINC01140和miR-140-5p对膀胱癌细胞侵袭性和M2巨噬细胞极化的动态影响

首先，我们确认了miR-140-5p和LINC01140与FGF9 3'UTR的结合。接下来，我们继续研究LINC01140和miR-140-5p对FGF9蛋白水平和膀胱癌细胞的动态影响。我们用si-LINC01140和抗miR-140-5p共转染T24细胞，然后测定相关指标。LINC01140敲除显著抑制，而miR-140-5p的抑制增强了T24细胞的活性(图6A)，迁移容量(图6C)和侵入能力(图6D); LINC01140基因敲除的作用通过抑制miR-140-5p而显著逆转。同样，LINC01140敲除显著抑制FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白水平，而miR-140-5p的抑制增强了FGF9，ki-67，MMP-2及MMP-9蛋白质水平；抑制miR-140-5p可显著逆转LINC01140敲除的作用(图6B). 关于巨噬细胞M2极化，用si-LINC01140和抗-miR-140-5p共转染T24细胞，并收集培养基（图中显示为条件培养基（CM）si-NC+抗-NC、si-LINC01140+抗-NC、si-NC+抗-miR-140-5p和si-LINC01140+抗-miR-140-5p）用于巨噬细胞孵育。在上述四种CMs中培养M0巨噬细胞，并相应极化为M1或M2。在M2极化条件下，在si-LINC01140+抗NC CM中培养显著降低M2标记CD206的表达(图6E)以及培养基中IL-10和Arg1的浓度(图6F). 相反，在si-NC+抗miR-140-5p CM中培养增加了M2标记物水平，包括CD206(图6E)、IL-10和Arg1(图6F). 在M1极化条件下，si-LINC01140+抗NC CM培养降低了M1标记物TNF-α和iNOS(图6F). 值得注意的是，在si-LINC01140+抗miR-140-5p CM的情况下，LINC01140敲除的作用通过抑制miR-140-5 p而显著逆转(图6E–6克)表明LINC01140以miR-140-5p为靶点，对抗miR-140-5 p介导的FGF9抑制，从而促进膀胱癌细胞的侵袭性和巨噬细胞M2极化。

LINC01140和miR-140-5p对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化T24细胞的动态影响用si-LINC01140与抗miR-140-5 p共转染，并用MTT法检测（A）细胞活性；（B）免疫印迹法检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白水平；（C）伤口愈合试验的迁移能力；和（D）Transwell分析的侵入能力。用si-LINC01140和抗miR-140-5p共同转染（E，F）T24细胞，收集培养基（如图所示，条件培养基（CM）si-NC+抗-NC、si-LINC01140+抗-NC、si-NC+抗-miR-140-5p和si-LINP01140+抗-miR 140-5p）进行巨噬细胞培养。在上述四种CMs中培养M0巨噬细胞，分别极化为M1或M2，并用免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平。（F）用ELISA法测定巨噬细胞培养液中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度*聚丙烯

图6。 LINC01140和miR-140-5p对膀胱癌细胞侵袭性和巨噬细胞M2极化T24细胞的动态影响与si-LINC01140及抗miR-140-5 p共转染，并检测其活性(一个)MTT法检测细胞活力；(B类)免疫印迹法检测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白水平；(C类)伤口愈合试验的迁移能力；和(D类)Transwell分析的侵入能力。(E类,F类)用si-LINC01140和抗miR-140-5p共同转染T24细胞，收集培养基（如图所示，条件培养基（CM）si-NC+抗-NC、si-LINC01140+抗-NC、si-NC+抗-miR-140-5p和si-LINP01140+抗-miR 140-5p）进行巨噬细胞培养。在上述四种CMs中培养M0巨噬细胞，并分别极化为M1或M2，并检测其(E类)免疫印迹法检测CD206和CD16的蛋白水平。(F类)用ELISA法测定巨噬细胞培养液中IL-10、Arg1、iNOS和TNF-α的浓度*对<0.05, **对与对照组相比<0.01#对<0.05, ##对与si-NC+抗miR-140-5p组相比，<0.01。统计分析采用单因素方差分析。

讨论

FGF9（成纤维细胞生长因子9）属于人类FGF家族，在胚胎发育、组织修复、肿瘤发生和许多其他生物学功能中发挥着关键作用[33–35]. FGF9被认为是胚胎发育所需的重要上皮-间充质转换信号[36]此外，据报道，它在各种肿瘤中表达，如结肠癌、胃癌和肺癌[37–39]. FGF9具有致癌活性，支持其在多种癌症发病机制中的作用。将人成纤维细胞生长因子9（FGF-9）cDNA转染到小鼠BALB/c 3T3克隆A31细胞中，可导致细胞形态改变、病灶形成、软琼脂生长和裸鼠体内肿瘤形成[40]. 在膀胱癌中，在线数据分析表明，与NMIBC组织相比，MIBC组织中FGF9的表达显著增加，表明FGF9上调可能与膀胱癌细胞的侵袭性有关。如前所述，高M2样极化巨噬细胞浸润与膀胱癌患者较差的临床结局相关[19]. M2巨噬细胞是膀胱癌相关巨噬细胞的主要类型，可加速膀胱癌的进展[18,19]. 值得注意的是，巨噬细胞M2极化在MIBC组织中更为常见。据报道，FGF9可以增强糖尿病梗死心脏M2巨噬细胞极化[17]; 因此，有理由推测FGF9可能调节巨噬细胞M2极化，从而影响膀胱癌细胞的侵袭性。正如预期的那样，T24膀胱癌细胞中FGF9的敲除显著抑制了细胞的生存能力、迁移能力和侵袭能力。更重要的是，在与来源于FGF9击倒T24细胞的条件培养基（si-FGF9-CM）孵育后，巨噬细胞的M2极化被阻断，这表明膀胱癌中FGF9的异常上调可能促进巨噬细胞M2极化，从而加速癌症的发展。

LncRNAs对肿瘤发生至关重要[41]. lncRNAs通过转录、转录后处理、染色质修饰、蛋白质功能调节和许多其他机制调节基因表达，从而参与各种肿瘤的发生过程[42,43]. 膀胱癌也显示多种lncRNA表达水平的变化。各种在体外和体内研究评估了敲除RNA对癌细胞表型和体内肿瘤生长[44]. 有趣的是，lncRNAs，包括MM2P[31]，马拉特1[30]，GNAS-AS1[45]和SNHG12[46]，据报道可调节巨噬细胞M1/2极化[47,48]. 根据在线数据，lncRNA LINC01140在MIBC中的表达明显增加，并与FGF9的表达呈正相关，表明其对膀胱癌有潜在影响。Song等人[49]据报道，较高水平的LINC01140与胃癌患者生存率降低有关。此外，基因集富集分析表明，高风险评分与肿瘤转移的某些分子途径呈正相关。在本研究中，T24细胞中LINC01140的敲低显著抑制了细胞的生存能力、迁移能力和侵袭能力。同样，用si-LINC01140-CM培养抑制巨噬细胞M2极化，表明LINC01140可能与FGF9协同调节膀胱癌中巨噬细胞M2的极化，从而影响癌细胞的侵袭性。

lncRNAs调节基因表达的机制的描述仍然是一个主要挑战。正如我们所提到的，lncRNAs可以通过转录、转录后处理、染色质修饰、蛋白质功能调节和许多其他机制调节基因表达。然而，越来越多的证据表明，lncRNAs可以通过其MRE（miRNA反应元件）竞争性靶向miRNAs，作为ceRNAs（竞争性内源性RNAs），从而调节miRNA下游靶RNA的表达[32]. 由于LINC01140和FGF9在膀胱癌组织中的表达呈正相关，本研究进一步寻找可能同时靶向LINC01140-FGF9的miRNAs。在两个候选miRNAs中，miR-140-5p和miR-580-3p在T24细胞中的表达与正常细胞相比显著下调。此外，实验结果证实了在线工具的预测，即LINC01140靶向miR-140-5p，而miR-140-5 p靶向FGF9。因此，LINC01140可能通过作为ceRNA减轻miR-140-5p诱导的FGF9抑制，从而影响膀胱癌中巨噬细胞M2极化。

miR-140-5p因其对多种癌症（如肝细胞癌）的抑癌作用而闻名[50]，卵巢癌[51]，结直肠癌[52,53]和下咽鳞癌[54]. 有趣的是，已经表明miR-140-5p靶向FGF9抑制肝细胞癌的生长和转移[50]. 通过siRNA（小干扰RNA）敲低FGF9导致与异位miR-140-5p表达相似的表型，而FGF9过度表达逆转了miR-140-5 p在肝细胞癌生长和转移中的作用[50]. 因此，T24细胞中miR-140-5p的抑制显著提高了癌细胞的生存能力、迁移能力和侵袭能力。与si-LINC01140-CM或si-FGF9-CM相比，抗miR-140-5p-CM显著促进巨噬细胞M2极化。总之，miR-140-5p的抑制逆转了LINC01140敲除对FGF9表达、膀胱癌表型和巨噬细胞M2极化的影响，表明miR-140-5 p介导LINC01140-FGF9之间的串扰，从而调节巨噬细胞M2的极化，影响膀胱癌细胞的侵袭性。

总之，LINC01140、miR-140-5p和FGF9形成一个lncRNA-miRNA-mRNA轴，调节膀胱癌表型，通过肿瘤微环境影响巨噬细胞M2极化，进而影响膀胱癌细胞的侵袭性(图7). 然而，该轴的应用还需要进一步体内和临床研究。

图7。 拟议机构的示意图。LINC01140/miR-140-5p/FGF9轴通过肿瘤微环境调节膀胱癌表型并促进巨噬细胞M2极化。

材料和方法

临床取样

12例肌层浸润性膀胱癌（MIBC）组织样本和12例非肌层浸润型膀胱癌（NMIBC）组织样本取自湘雅第二医院经机构伦理委员会批准的临床和组织学诊断的患者。每个登记的患者都获得了书面知情同意书。临床特征如所示补充表1.

细胞系和细胞转染

人类膀胱上皮SV40永生化细胞系SV-HUC-1（ATCC®CRL-9520）是从ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯市，美国）获得的，并在补充有10%FBS的F-12K培养基（目录号30-2004，ATCC）中培养。膀胱癌细胞系T24（ATCC™HTB-4）是从ATMC获得的，并且在McCoy的5a改良培养基中培养（目录号30-2007，ATCC添加10%FBS。所有细胞在37°C和5%CO中培养₂.

miR-140-5p的表达通过转染miR-140-5 p或抗miR-140-5p进行调节（GenePharma，中国上海）。通过转染si-FGF9或si-LINC01140（GenePharma），FGF9或LINC01140被敲除。所有转染均使用转染剂Lipofectamine 3000（Invitrogen）进行。相关序列如所示补充表2.

生物信息分析

为了确定与MIBC相关的基因，我们从基因表达总览（GEO）下载了一个微阵列表达谱数据集GSE77952。该数据集报告了14例MIBC和16例NMIBC组织中差异表达的基因，包括蛋白编码RNA和非编码RNA。在该数据集中，MIBC中共有45种细胞因子被解除管制；经文献复习，选择FGF9进行进一步实验。

生存分析

为了分析FGF9或LINC01140表达与膀胱癌患者总生存率的相关性，我们使用美国国家癌症研究所的基因组数据共享端口数据库（GDC，genomic data Commons；https://portal.gdc.cancer.gov网站/). 我们从存储库页面的项目菜单中选择TCGA-BLCA，从文件菜单中下载转录组数据（转录组分析），然后选择RNA-seq（HTseq-Counts）公共数据；样本总数为434个。使用R语言工具读取每个样本的测序数据，并将其整合到一个表达矩阵中。然后用DEseq2和Edge R软件包对表达矩阵进行均质化，得到标准化表达矩阵。FGF9（ENSG00000102678）和LINC01140（ENSG0000267272）的标准化基因表达数据从该矩阵中提取。通过生存和survminer R包获得生存曲线。使用R语言包（RTCGA.clinical）分析原始生存数据。所使用的参数包括患者生存率（patient.vital_status）、从随访到死亡的时间（patiet.ups.follow_up.days_to_death）以及患者在最后一次随访时的存活时间（pateet.ups.follow_up.days_to_last_followup）。上述所有参数均以天表示。在处理生存数据时，删除了生存时间小于30天或缺失值的病例，因为生存时间小于30天可能代表由于术后健康状况迅速恶化而导致的死亡，并且可能与肿瘤基因表达没有直接关系。最后，对286例患者进行了分析。当根据基因表达的中值对病例进行分组时，高表达组和低表达组的比率的最小值为30/70，即两组样本必须分布在30%和70%之间（minprop=0.3），以确保两组样本之间没有大的偏差。采用单因素Cox回归分析对总生存率进行分析。

基于PCR的分析

使用TRIzol试剂（类别：15596018，Invitrogen）从靶组织或细胞中提取总RNA。然后，使用SYBR Green qPCR分析（Cat.DRR820A，Takara，Dalian，China），按照上述方法，通过实时PCR测定lncRNA、miRNA和mRNA的表达[55]. RNU6B或GAPDH的表达被用作miRNA或mRNA表达计算的内源性控制。使用2生成数据处理和相对折迭计算^-ΔΔCT方法。引物序列列于补充表2.

免疫印迹法

为了监测FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白水平的变化，我们按照上述方法进行免疫印迹[55]使用CD206、CD16、FGF9、ki-67、MMP-2和MMP-9抗体（ab64693、ab46679、ab71395、ab15580和ab38898，英国剑桥Abcam），然后用适当的HRP-结合二级抗体进行另一次培养。GAPDH（ab16891，Abcam）被用作内源性对照。使用增强化学发光（ECL）底物（WBKlS0100，Millipore，MA，USA）对信号进行可视化，并将其归一化为GAPDH信号。

苏木精和伊红（H&E）染色

将MIBC和NMIBC组织固定在4%多聚甲醛中24 h。然后，将组织块脱水，包埋在石蜡中，并切割成4μm厚的切片。脱蜡后，使用标准程序用H&E对切片进行染色[56,57].

膀胱癌组织的免疫荧光（IF）染色

为了检测膀胱癌组织中的CD163，将组织样本固定在4%甲醛中并嵌入石蜡中。用100 mM氯化铵缓冲液封闭组织10分钟，以尽量减少自体荧光。用含有10%马血清的PBS封闭非特异性结合位点，然后用CD163特异性一级抗体（ab87099，Abcam）在4°C下培养过夜，并在封闭溶液中稀释。将Cy3-共轭山羊抗兔二级抗体（A0516，Beyotime，中国）在室温下孵育1小时。在拍摄图像之前，使用DAPI（C1002，Beyotime，中国）染色细胞核。这些图像是使用荧光显微镜（日本尼康）获得的。红色荧光表示CD163表达，蓝色荧光表示细胞核。

单核细胞分离和分化为巨噬细胞

从健康志愿者的静脉血中获得人外周血单个核细胞（PBMC），并通过Ficoll密度梯度离心分离。接下来，按照制造商的说明，使用抗CD14磁珠（美国生命科技公司）从PBMC中分离单核细胞。去除非粘附细胞，纯化单核细胞在添加10%FBS的RPMI 1640培养基中培养一周。然后，使用50 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF；R&D Systems，USA）七天以获得M0巨噬细胞。为了刺激M0巨噬细胞分化为M1或M2巨噬细胞，该研究使用100 ng/ml LPS（Sigma-Aldrich）+20 ng/ml IFN-γ（eBioscience）刺激M0细胞，诱导M1极化，或使用20 ng/mlIL-4（eBioscience[58–60].

为了通过流式细胞仪测定巨噬细胞表面标记物，用抗CD11b（ab24874，Abcam）、抗CD206（ab223960，Abcam）或抗CD16（ab234209，Abcan）荧光结合抗体对细胞进行染色。然后使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences）中巨噬细胞表面标记的流式细胞术分析对样品进行定量。同型对照显示在补充图1为了通过IF测定巨噬细胞表面标志物，将细胞接种在盖玻片上过夜，用4%多聚甲醛PBS固定，并在4°C下与抗CD11b（ab8878，Abcam）、抗CD206（ab64693，Abcam）或CD16（ab46679）孵育过夜。将FITC-结合或TRITC-结合二级抗体（中国Beyotime）在室温下孵育1h。细胞核用DAPI（KeyGen Biotech）染色。用荧光显微镜拍摄图像。

MTT法评估细胞活力

通过遵循上述方法[61]，检测到细胞活力。转染或处理后，添加MTT（20μl，密度为5 mg/ml；Sigma-Aldrich），并进行另一个4小时培养。在培养结束时，加入二甲基亚砜（200μl）以溶解甲赞。接下来，在490 nm处测量OD值，并通过将未处理细胞存活率（对照）定义为100%来计算相对细胞存活率。

伤口愈合试验评估细胞迁移能力

细胞以5×10接种在6孔板中⁵细胞/ml，直至细胞形成单层，然后进行细胞伤口愈合试验。在显微镜下（日本奥林巴斯）在0 h和48 h测量划痕区域。在显微镜下测量细胞迁移到划痕区域的相对距离，并使用ImageJ软件（美国NIH）进行分析。

Transwell法评估细胞侵袭能力

电池（5×10⁵)镀在涂有Matrigel的聚碳酸酯Transwell过滤器的顶部。对于Transwell侵袭试验，将细胞悬浮在无血清培养基中，并将含血清培养基添加到底室中。将细胞在37°C下孵育48小时。用棉签去除顶部腔室中的非侵入性细胞。将下膜表面的侵袭细胞在100%甲醇中固定10分钟，风干，用结晶紫溶液（C0121，Beyotime）染色，然后在显微镜下计数。

酶联免疫吸附试验

采集培养上清液并离心以去除细胞碎片，将等分样品储存在-80°C下，直到进行分析。按照上述方法，使用相应的人类ELISA试剂盒（IL-10:D1000B，R&D Systems；Arg1:P05089，Cusabio，Houston，TX，USA；iNOS:P35228，Cusabilo；TNF-α：DTA00D，R&D Systems）测定IL-10、Arg1、iNOS和TNF-[62].

荧光素酶报告试验

为了验证miR-140-5p与LINC01140或FGF9的3'UTR之间的结合，在psiCHECK2载体（Promega，Madison，WI，USA）中的Renilla基因下游克隆了野生型或突变的LINC01140。接下来，将293T细胞与两种荧光素酶报告载体和miR-140-5p-mimics/miR-140-5p抑制剂共同转染，并使用双荧光素酶报告检测系统（Promega）检测荧光素素酶活性。

数据处理和统计分析

使用GraphPad软件对数据进行分析。测量数据表示为平均值±标准偏差（SD）。使用方差分析和Student’st吨-测试。对<0.05表示有统计学意义的差异。

补充资料

补充数据

补充表格

缩写

MIBC：肌肉浸润性膀胱癌；非肌层浸润性膀胱癌；LncRNA：长的非编码RNA；TME：肿瘤微环境。

作者贡献

RX和SW设计了实验，SW、JZ、HH和XZ进行了实验，分析了数据，并准备了手稿；QZ、SW和YW执行生物信息学和统计分析；RX、SW和XZ修订了手稿。所有作者讨论了项目所有阶段的结果和数据解释。

利益冲突

这些作者声明没有利益冲突。

基金

本研究得到湖南省科学技术厅（no.2020JJ4820）的资助。

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