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.2020年4月3日;21(1):24.
doi:10.1186/s12860-020-00256-3。

PGRMC1磷酸化影响细胞形状、运动、糖酵解、线粒体形态和功能以及肿瘤生长

附属公司

PGRMC1磷酸化影响细胞形状、运动、糖酵解、线粒体形态和功能以及肿瘤生长

巴沙尔·梅塞耶等。 BMC分子细胞生物学. .

摘要

背景:孕酮受体膜成分1(PGRMC1)在许多癌细胞中表达,并与有害的患者预后相关。它含有磷酸化酪氨酸,在进化上先于后胃造口原肠形成和组织分化机制。

结果:我们证明,在MIA PaCa-2(MP)细胞中操纵PGRMC1磷酸化状态可产生广泛的多效性效应。相对于过度表达血凝素标记的野生型(WT)PGRMC1-HA的亲本细胞,表达PGRMC1-HA-S57A/S181A双突变体(DM)的细胞表现出参与能量代谢和线粒体功能的蛋白质水平降低,并且葡萄糖代谢改变,这表明Warburg效应的调节。这与PI3K/AKT活性增加、细胞形状改变、肌动蛋白细胞骨架、运动性和线粒体特性有关。一个S57A/Y180F/S181A三重突变体(TM)表明Y180参与PI3K/AKT激活。Y180F突变强烈抑制NOD-SCIDγ小鼠皮下异种肿瘤的生长。在其他地方,我们证明了这些细胞中代谢、突变发生率和表观遗传学状态的改变。

结论:总之,这些结果表明,PGRMC1磷酸化状态的突变操作具有广泛的多效性效应,与癌症和其他细胞生物学相关。

关键词:细胞色素P450;入侵;间充质变形虫转变;代谢;迁移;线粒体;蛋白质组学;肿瘤生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

M.A.C.是Cognition Therapeutics的科学顾问和小股东,该公司开发抗阿尔茨海默病的sigma-2受体配体。这项工作是独立完成的,没有公司的投入。提交人声明,他们没有其他竞争利益。

数字

图1
图1
胰腺癌细胞形态受PGRMC1磷酸化状态的影响。为该图构建的PGRMC1-HA蛋白。TMH:跨膜螺旋。HA:C端3x血凝素标签。b条通过western blot检测外源性PGRMC1表达水平(上面板)。通过量化β-肌动蛋白(下面板)来控制平均负荷。结果显示(A)中每个质粒有三个完全独立的稳定转染细胞系。开放箭头:外源性PGRMC1-HA(例如)。阴影箭头:内源性PGRMC1(结束)。填充箭头:β肌动蛋白。分子量阶梯为Bio-Read 1610377双Xtra标准。c(c)方框图量化了(B)的复制凝胶,信号标准化为来自相同相应通道的β-肌动蛋白。n个 = MP和4车道n个 = WT、DM和TM为6(每种情况下各生产线1-3的复制品)。除MP中的外源带外(ANOVA,post-hoc Dunnet’s T3),无显著差异(ns)。d日Western blot定量检测HA标记的外源性PGRMC1,B后用抗HA抗体检测PGRMC1。分子量阶梯为Abcam ab116028预染蛋白阶梯。e(电子)PGRMC1突变蛋白表达改变MIA-PaCa-2细胞形态。用FITC-标记的抗-HA抗体(anti-HA)对表达PGRMC1-HA的稳定细胞(B的相应系1)或MP细胞进行染色,并通过共焦显微镜进行成像。DNA用DAPI染色。细胞也在微分干涉对比(DIC)显微镜模式下成像。相应的左侧面板显示所有3个通道的合并图像。如果双突变体和三突变体(E)的圆形表型在125μM ROCKI添加,但不通过添加二甲基亚砜载体对照
图2
图2
PGRMC1磷酸化状态影响运动和侵袭。在划痕试验中,DM细胞表现出更强的运动能力。36天后划痕试验的代表性结果细胞迁移h。对每幅图像的划痕空白区域的方框区域中的细胞进行计数。b条划痕分析细胞迁移结果。细胞迁移到(A)中描述的多个复制的划痕空白框区域的框线图。n个 = 12(MP)或4次复制WT和TM的子系1-3(n个 = ×4 = 12). 该表显示了采用事后邓内特T3的单因素方差分析结果第页-值。S1文件中提供了细胞迁移的视频文件。c(c)在Geltrex侵袭试验中,DM细胞的侵袭性降低。transwell嵌件下表面晶体-叶绿体染色细胞的代表性图像。d日入侵检测的箱线图由SPSS软件生成的(C)重复数据得出。n个 = 30(MP)或10次复制WT和TM的子系1-3(n = ×10 = 30). 表中显示了Kruskal-Wallis第页-两两比较的值
图3
图3
SWATH-MS蛋白质组学结果的通路分析。路径在adjP>处显著丰富“红色”和“蓝色”差异蛋白(红色 = 较高丰度,蓝色 = 低丰度,白色 = 等丰度)。左上角:243个显著差异蛋白质的蛋白质组热图。右上角给出了WebGestalt路径的颜色代码。底部:网络格式塔路径映射。此图像来自文件S6,其中包含所有蛋白质和网络格式塔通路身份
图4
图4
RPPA测量蛋白质和磷酸化蛋白质水平。-d日,如果-小时根据6次重复测量绘制了所示抗体的平均RPPA归一化荧光强度(NFI)(如方法所述)。NFI标准化为蛋白质含量。使用单向方差分析对正态分布数据进行统计计算,并对等方差(所有方差均相等)进行事后Bonferroni(BF)。对于非参数数据,计算了24个无关样本的Kruskall-Willis(KW)成对比较*第页 < 0.05; **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 由于信号值小于背景值的三倍,因此无法准确测定非磷酸化BAD水平。e(电子)D相对于C的平均NFI比率。标签如下
图5
图5
PGRMC1磷酸化状态影响葡萄糖摄取、乳酸分泌和线粒体功能。使用Cayman“糖酵解”试剂盒的细胞对葡萄糖的摄取。箱线图表示四个技术复制品,每个复制品对应于WT、DM和TM条件下独立稳定转染的子线1-3(图1中的线)。即n = 4× = 每种情况12个。对于MP细胞,重复12次MP细胞系。所有方法(Kruskal-Wallis第页 < 0.0001,两两样本Kolmogorov-Smirnov检验第页 < 0.0002).b条细胞系的乳酸分泌。详细信息如下(A),除了测量了每个稳定细胞系的副本(n = ×2 = 每种情况6个)。细胞间类型比较测试表明,所有两两比较的平均值彼此之间存在显著差异(ANOVA、事后Dunnet的T3、,第页 < 0.003),但WT-TM比较不显著(第页 = 0.211).c(c)线粒体的最大呼吸能力受PGRMC1磷酸化状态的影响。每个PGRMC1-HA突变条件WT、DM和TM的各自独立克隆稳定系C1的线粒体耗氧量。箭头表示添加ATP合酶抑制剂寡霉素、Δψm解偶联剂FCCP和电子传递链抑制剂鱼藤酮和抗霉素A的时间。OCR:耗氧率(每μg蛋白质标准化pmol/min),n个 = 5; 平均+/-s.d。
图6
图6
PGRMC1磷酸化同时影响线粒体和细胞形态。图像显示,每种细胞类型的伸长或圆形细胞的形状因子(avFF)值接近平均值。显示了每个类别中得分的单元格数。所有细胞图像都以相同的比例再现。b条伸长和圆形细胞()按细胞类型检查。左上角的面板显示了所有3个重复中每种细胞类型的三个独立生物复制细胞系的平均细长细胞百分比(n(∑1–3))对应于(A)中给定的n个值。其余面板显示了面积、周长和FF各形状和类型类别中细胞的分布。Kruskal-Wallis分析显示第页 < 任何细长细胞类型比较(ns)之间均为0.05水平,而圆形细胞的所有细胞类型均表现出显著差异(Kruskal-Wallis,P(P) < 0.001). 随附的Kruskal-Wallis事后成对比较第页-圆形单元格的值在相应的表中给出。c(c)绘制的每个单元格的平均FF,包括单元格形状。细胞在圆形和细长形态(avFF 2.2–2.6)之间过渡的值用虚线表示
图7
图7
PGRMC1 Y180有助于小鼠皮下异种移植物肿瘤的生长。培养中细胞加倍时间没有差异。对每种情况下稳定细胞系1–3的复制进行测量,得出n个 = 6.细胞条件之间没有显著差异。b条每一类细胞产生的典型肿瘤。c(c)注射2×106每个细胞系的细胞。对于WT、DM和TM,结果显示第2行和第3行各有4只小鼠,第1行有5只小鼠。MP和Y180F分别代表单个细胞系的5个重复。该框显示了成对的事后邓内的T3第页-单向方差分析后的值

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