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。2020年1月17日；11（1）：341。
doi:10.1038/s41467-019-14183-1。

TDP-43通过转录后调节Btn1a1和Xdh促进乳脂分泌

赵利民 # 1 2, 郝珂 # 1 2, 徐海波 1 2, 王国栋 1 三, 张洪磊 1, 李邹 1, 舒香 4, 李梦媛 5, 李鹏 6, 周明芳 5, 玲玲·李 1 7, 雷傲 8, 秦阳 1, 车昆·詹姆斯·沈 9, 平易 10, 卢旺（Lu Wang） 11, Baowei Jiao公司 12 13 14
附属公司

TDP-43通过转录后调节Btn1a1和Xdh促进乳脂分泌

赵利民等。 国家公社。 。

摘要

乳脂分泌是父母向后代传递营养和能量的关键过程。然而，其潜在的分子机制尚不清楚。在这里，我们报告了TDP-43，一种RNA-结合蛋白，在哺乳动物谱系中经历了正向选择。此外，TDP-43基因（Tardbp）的缺失会导致乳腺上皮细胞内大脂滴的积聚和严重的脂质分泌不足，最终导致产后三周内哺乳失败和幼崽饥饿。在哺乳期妇女的母乳样本中，TDP-43的表达水平与较高的产奶量呈正相关。从机制上讲，TDP-43对Btn1a1和Xdh mRNA稳定性进行转录后调节，这是上皮细胞向腔分泌脂滴所必需的。总之，我们的结果强调了TDP-43在乳脂分泌中的关键作用，为临床泌乳不足的筛查和干预提供了潜在的策略。

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数字

图1
图1。TDP-43缺失导致乳腺上皮泌乳失败。
一C57BL/6雌性小鼠不同发育阶段（V，处女；P17.5，妊娠第17.5天；L1，泌乳第1天；L2，哺乳第2天；L10，哺乳第10天；I3，退化第3天）乳腺中TDP-43的免疫组织化学（IHC）染色。每个阶段显示四只小鼠的代表性图像（×40物镜放大倍数）。比例尺：20 微米。b条,c（c）野生型（WT）和Tardbp公司−/−第一只雌性小鼠(b条)和第二个(c（c）)哺乳期，每窝产7只幼崽。WT代表Tardbp公司重量/重量+WAP-Core鼠标。Tardbp公司−/−代表Tardbp公司飞行/飞行+WAP-Core鼠标。n个代表母亲的数量。d日WT和Tardbp公司−/−在L2上，每一个养母的产仔数调整为7个。e（电子）WT和Tardbp公司−/−母亲。由其亲生母亲（WT或Tardbp公司−/−，黑线）并由养母进行交叉护理(Tardbp公司−/−或WT）在L2（蓝线）和L10（红线）处记录，每个水坝从L2开始有七只幼崽。（f）在L2上，将第二次哺乳后的幼崽体重调整为7。数据是手段 ± SD.源数据作为源数据文件提供。
图2
图2。乳汁分泌受损Tardbp公司−/−雌性小鼠。
一野生型（WT）和Tardbp公司−/−10只雌性小鼠 催产素刺激U(n个 = 每个基因型7个）。b条从WT和Tardbp公司−/−哺乳第2天的小鼠（L2）(n个 = 每个基因型6个）。c（c）,d日从WT和Tardbp公司−/−L2（C）小鼠(n个 = 每个基因型5个）或L10（D）(n个 = 每个基因型6个）。数据是手段 ± 标准偏差(一)或表示(b条–d日). MEC中的TAG水平标准化为每个样品的蛋白质浓度。未付款t吨检验用于评估统计学意义*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001. 源数据作为源数据文件提供。
图3
图3。MEC中存在较大的脂滴Tardbp公司。
一,b条相位对比显微照片(一)和统计数据(b条)来自野生型（WT）和Tardbp公司−/−在哺乳第2天（L2）使用Image-Pro Plus 5.0对小鼠进行分析（左，n个 = 7只老鼠）或L10（右，n个 = 6只小鼠）。比例尺：100 微米。数据是手段 ± SD.未准备t吨检验用于评估统计学意义***P（P） < 0.001.c（c）WT和WT乳腺的苏木精和伊红染色Tardbp公司−/−L1、L2和L10的小鼠。L10的放大区域显示在红色框中（左侧）。箭头显示细胞中的细胞质脂滴（CLD），箭头显示肺泡腔内的大脂滴（LD）。比例尺：20 微米。d日嗜脂蛋白（PLIN2）免疫荧光染色（红色）显示WT和WT乳腺腺泡中的LDsTardbp公司−/−L1和L2的小鼠。切片还用小麦胚芽凝集素（WGA）（绿色）和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）染色，以勾勒出管腔边界或细胞核。放大区域（右侧）显示在白色框（左侧）中。比例尺：10 微米。e（电子）WT和WT乳腺切片的电子显微镜图像Tardbp公司−/−L1小鼠。箭头表示细胞核，星号表示乳腺管腔。比例尺：2 微米。源数据作为源数据文件提供。
图4
图4。TDP-43调节BTN和XOR的表达。
一野生型（WT，n个 = 3） 和Tardbp公司−/−（KO，n个 = 4） 哺乳第1天的小鼠（L1）。条形图的颜色表示标准化和缩放的表达式级别（红色、白色和蓝色分别对应于最高值、中间值和最低值）。b条定量实时PCR（qRT-PCR）分析Btn1a1号机组以WT和Tardbp公司−/−L1级小鼠(n个 = 5只小鼠）和L10(n个 = 4只小鼠）。c（c）定量实时PCR分析Xdh公司以WT和Tardbp公司−/−L1级小鼠(n个 = 5只小鼠）和L10(n个 = 5只老鼠）。d日,e（电子）Western blot显示妊娠第17.5天分离的MEC中BTN和XOR的表达(d日)和L1(e（电子）)来自WT和Tardbp公司−/−老鼠。（f）分化HC11细胞株BTN和XOR的蛋白水平Tardbp公司击倒。数据是手段 ± SD.未准备t吨检验用于评估统计学意义*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 源数据作为源数据文件提供。
图5
图5。TDP-43直接绑定到Btn1a1号机组和Xdh公司mRNA。
一mRNA结构Btn1a1号机组（上部）和Xdh公司（下部）显示3′-UTR中的TDP-43结合基序。深绿色方框表示编码区域。浅绿色方框表示非编码区域。b条,c（c）RNA免疫沉淀（RIP）分析TDP-43蛋白与Btn1a1号机组或Xdh公司利用TDP-43抗体在MEC和分化HC11细胞系中表达mRNA。d日,e（电子）机械工程师(d日)和分化HC11(e（电子）)细胞提取物与体外转录生物素标记对照（pcDNA3.1载体）孵育，Btn1a1号机组，或Xdh公司生物素RNA下拉mRNA片段，然后进行western blot分析。对照RNA使用无TDP-43结合位点的生物素化RNA（ugugug）。（f）RIP分析中使用的TDP-43及其突变体的结构。TDP-43蛋白包含一个N末端结构域（N末端）、两个RNA-再认识基序（RRM1和RRM2）、一个富含甘氨酸的结构域（GRD）和一个C末端结构域。克HC11细胞系中过度表达Flag-TDP-43或其突变体的Western blot。小时在过度表达标记-TDP-43或TDP-43的标记突变后，在分化的HC11细胞中使用标记抗体进行RIP分析。我鼠标示意图Btn1a1号机组或Xdh公司用于RNA下拉分析的mRNA片段。j个TDP-43蛋白与片段之间的结合Btn1a1号机组和Xdh公司mRNA。四生物素化Btn1a1号机组信使核糖核酸片段或六个生物素化的Xdh公司mRNA片段与HC11细胞提取物孵育，通过RNA下拉和western blot分析检测TDP-43和每个片段之间的相互作用。数据显示为平均值 ± 三个独立实验的SD。源数据作为源数据文件提供。
图6
图6。TDP-43损失减少Btn1a1号机组和Xdh公司mRNA稳定性。
一,b条妊娠第17.5天分离出的主要MEC（P17.5）(一)哺乳第1天（L1）(b条)来自野生型（WT）和Tardbp公司−/−用放线菌素D处理小鼠指定时间，然后Btn1a1号机组,Xdh公司、和Gapdh公司用qRT-PCR分析mRNA表达水平。数据标准化为18S rRNA每个实验中的水平，并表示为在时间0测量的mRNA水平的百分比 h（添加放线菌素D之前）使用半对数刻度。半衰期(t吨1/2)计算每个mRNA减少到其初始丰度50%的时间。c（c）qRT-PCR分析Btn1a1号机组和Xdh公司对照组（Flag）、Flag-TDP-43全长（Flag-FL）和Flag-TDP-43 C-term（Flag-C-term）过度表达后，用放线菌素D处理的分化HC11细胞中的mRNA表达。d日上部：含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的报告基因结构示意图Btn1a1号机组和Xdh公司mRNA 3′-UTR。绿色荧光蛋白-Btn1a-1-mutUTR和GFP-Xdh-螺母由UG-enrich序列的缺失突变产生Btn1a1型（位置2845–2864、2935–2972、3319–3326和3365–3372 nt）和Xdh公司（位置4523–4538 nt）分别为3′-UTR。较低：通过western blotting 72测定GFP表达水平 与GFP报告基因和sh-TDP-43共转染后h。sh-TDP-43-1和sh-TDP-4 3-2代表使用的独立shRNAs。数据显示为平均值 ± 三个独立实验的SD。源数据作为源数据文件提供。
图7
图7。TDP-43缺失导致早期退化。
一野生型乳腺（WT）和Tardbp公司−/−哺乳第15天（L15）、L18和L21的小鼠。放大的区域显示在黑色框中。比例尺：1 毫米。b条–d日哺乳期间不同时间采集的乳腺石蜡切片，并用苏木精和伊红染色。箭头显示乳脂滴，箭头显示脱落细胞。比例尺：100 微米。
图8
图8。TDP-43低表达与人类泌乳不足有关。
一MSCs中细胞特异性标记物mRNA表达水平的量化（乳体细胞，n个 = 3） 和MFG（乳脂肪球，n个 = 3). 通过离心法从新鲜母乳中获得MSCs。多形核中性粒细胞的特异性标记物(CD18型和GPR97标准)，淋巴细胞(CD3e公司)，巨噬细胞(CD18型和CD68型)和编码乳蛋白的MEC基因(CSN1S1型,CSN2型,CSN3号机组、和LALBA公司)如图所示。b条,c（c）qRT-PCR分析TARDBP公司(b条)和HNRNPA1型(c（c）)产后3-5天新鲜母乳MFG中的mRNA表达水平。纯母乳喂养，n个 = 45；部分母乳喂养，n个 = 13; 配方奶粉喂养，n个 = 2d日TDP-43调节乳脂分泌作用的图形摘要。数据是手段 ± SD.未准备t吨检验用于评估统计学意义*P（P） < 0.05; 不另作说明，不重要。源数据作为源数据文件提供。
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