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。2019年7月17日5:517。
doi:10.1038/s41420-019-0199-x。 2019年eCollection。

DRP-1的功能独立于线粒体结构扰动，以促进BH3模拟物介导的细胞凋亡

马特乌斯·米拉尼 1, 艾莉森·贝克特 2, Aoula Al-Zebeby公司 1, 徐罗 三, 伊恩·A·普赖尔 2, 杰拉尔德·科恩 1 4, Shankar Varadarajan公司 1 4
附属机构

DRP-1的功能独立于线粒体结构扰动促进BH3模拟物介导的凋亡

马特乌斯·米拉尼等。 细胞死亡迪斯科。 。

摘要

线粒体完整性的维持对正常细胞的同型性至关重要。大多数细胞对应激刺激作出反应，并通过扰乱线粒体结构和功能来释放蛋白质，如细胞色素，从而发生凋亡c（c），这是执行内在凋亡级联所必需的。癌细胞通过在线粒体膜上过度表达抗凋亡BCL-2家族蛋白来逃避这些事件。抗凋亡BCL-2家族蛋白的抑制剂，也称为BH3模拟物，拮抗这些蛋白的促生存功能并导致快速凋亡。虽然BH3模拟物诱导细胞凋亡的确切机制已经得到了很好的描述，但在细胞凋亡期间线粒体发生的结构变化方面还不太清楚。使用一组高选择性的BH3模拟物和广泛的细胞系，我们证明BH3模拟体可诱导广泛的线粒体分裂，同时伴有线粒体基质肿胀和线粒体外膜破裂。这些变化以BAX/BAK相关的方式发生。尽管一种主要的线粒体分裂GTPase DRP-1与线粒体凋亡有关，但我们的数据表明DRP-1可能在BH3模拟物介导的线粒体分裂的下游独立发挥作用，促进细胞色素的释放c（c）和凋亡。此外，下调DRP-1可阻止细胞色素c（c）即使OPA1（一种介导线粒体融合的蛋白质）被沉默，也会释放和凋亡。虽然BH3模拟介导从BCL-X中置换BAK和其他BH3-only蛋白L（左）并且MCL-1不受DRP-1下调的影响，它显著阻止了BAK的激活，从而使DRP-1与BAX和BAK一起成为调控BH3模拟物介导的细胞色素的最关键的参与者之一c（c）释放和凋亡。

关键词：细胞死亡；器官。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。BH3模拟物在不同细胞的线粒体中诱导显著的超微结构变化。
一MAVER-1型，b条K562，c（c）H929和d日H1299细胞暴露于Z-VAD.fmk（30 µM）为0.5 h、 其次是ABT-199（100 nM），A-1331852（100 nM），A-1210477（10 µM），或a-1331852（100）的组合 nM）和A-1210477（10 µM），分别用于4 h，并通过电子显微镜评估线粒体结构变化。黄色箭头表示线粒体外膜的断裂区域。比例尺：500 纳米
图2
图2。BH3模拟物以BAX和BAK依赖但不依赖BH3的方式破坏线粒体。
HCT-116 WT、DKO（BAX/BAK缺陷）和OctaKO细胞暴露于Z-VAD.fmk（30 0.5微米） h、 然后是a-1331852（100 nM）和A-1210477（10 µM）用于4 h，并通过电子显微镜评估线粒体结构变化。比例尺：500 纳米
图3
图3。A-1210477和S63845介导的线粒体分裂以DRP-1依赖方式发生。
一H1299细胞暴露于Z-VAD.fmk（30 0.5微米） h、 然后是A-1331852（100 nM），A-1210477（10 微米），S63845（100 nM）或4种不同抑制剂的组合 h，用HSP70抗体免疫染色评估线粒体完整性。b条用对照或DRP-1 siRNA转染H1299细胞72 h并暴露于A-1210477（10 µM）或S63845（1和10 µM）用于4 h，并评估线粒体完整性。在三个独立的实验中，通过分析每种情况下约100个细胞来量化线粒体断裂的程度。比例尺：10 微米。误差线 = 意思是 ± SEM。通过单向方差分析进行统计分析(***P（P）≤0.001)
图4
图4。在BH3模拟物介导的凋亡过程中，线粒体分裂不需要DRP-1。
用对照MCL-1或BCL-X转染H1299细胞L（左）siRNA，单独或与DRP-1 siRNA结合72 h、 然后暴露于Z-VAD.fmk（30 µM）为0.5 h、 然后是A-1210477（10 µM）和/或A-1331852（100 nM）用于4 h，用HSP70抗体免疫染色评估线粒体完整性。图像中的方框区域被放大，以显示所示细胞中的线粒体结构变化。比例尺：10 微米
图5
图5。DRP-1调节BH3模拟诱导的细胞色素c（c）线粒体嵴重构下游的释放和凋亡。
一转染DRP-1 siRNA 72的H1299细胞的电镜观察 h在存在或不存在所示BH3模拟物的情况下 h.黄色箭头表示线粒体外膜破裂。比例尺 = 10 纳米。b条用DRP-1 siRNA或GFP-DRP-1 K38A质粒转染H1299细胞72 h、 暴露于Z-VAD.fmk（30 0.5微米） h、 然后是a-1331852（100 nM）和A-1210477（10 µM）用于4 h与细胞色素的范围c（c）通过共焦显微镜评估线粒体释放。图像中的方框区域被放大，以显示所示细胞中的线粒体结构变化。细胞色素的范围c（c）通过计数三个独立实验中的至少100个细胞来量化释放。c（c）等同于b条但细胞色素的范围c（c）western blotting分析DRP-1 siRNA的释放、OPA1处理和沉默效率。d日H1299细胞用指示的siRNA转染72 h、 按中所述处理b条细胞色素的范围c（c）评估并量化释放。细胞色素的范围c（c）通过对来自三个独立实验的至少100个细胞进行计数来定量释放。e（电子）等同于d日但细胞暴露于BH3模拟物中，不含Z-VAD.fmk，并通过至少三个独立实验的PS外化评估凋亡程度。所有比例尺，除非另有说明：10 微米。误差线 = 意思是 ± SEM。通过单向方差分析进行统计分析(***P（P）≤0.001)
图6
图6。DRP-1调节BH3模拟诱导的BAK激活。
一展示BH3模拟物的主要作用机制和最终导致细胞凋亡的下游事件的方案。b条BCL-X免疫沉淀L（左）在H1299细胞中进行MCL-1，用对照或DRP-1 siRNA转染，然后暴露于Z-VAD.fmk（30 0.5微米） h和a-1331852（100）的组合 nM）和A-1210477（10 µM）用于4 h、 对洗脱的复合物进行免疫印迹，以检测指示蛋白。c（c）H1299细胞被视为b条并且通过流式细胞术从至少三个独立实验中评估BAK激活的程度。误差线 = 意思是 ± SEM。通过单向方差分析进行统计分析(***P（P）≤0.001).d日大小排阻色谱中不同分子量组分的蛋白质印迹显示暴露于A-1331852（100）后H1299细胞中BAK齐聚 nM）和A-1210477（10 2µM） 小时。e（电子）活性BAK在H1299细胞中的免疫沉淀b条对洗脱的复合物进行免疫印迹，以检测指示蛋白。（f）显示BAK激活和DRP-1在H1299细胞中分布的代表性细胞图像b条.比例尺：10 微米
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