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.2019年7月18日；10(8):552.
doi:10.1038/s41419-019-1763-2。

HDAC9增加通过缺氧时自噬的表观遗传调节抑制成肌细胞分化

张张 1, 张丽强 2, 游周 三, 李亚丽 2, 赵江东 4, 文琴 2, 左林金 5, 刘文佳 6
附属公司

HDAC9的增加通过缺氧条件下自噬的表观遗传学调节抑制成肌细胞分化

张张等。 细胞死亡病. .

摘要

极端还原氧（O2)该水平不利于肌源性分化和多核肌管的形成，长期暴露于高原缺氧已被报道为骨骼肌萎缩的重要因素。然而，慢性缺氧如何导致肌肉功能障碍尚不清楚。在本研究中，我们发现严重缺氧（1%O2)显著抑制C2C12细胞（来自成肌细胞系）的功能。重要的是，即使在常氧条件下培养几代，这种损伤也会持续出现。从机制上讲，我们发现组蛋白脱乙酰化酶9（HDAC9）是组蛋白脱乙酰基酶家族的一员，在缺氧条件下，C2C12细胞中的组蛋白脱乙酰基酶显著增加，从而通过直接结合Atg7、Beclin1和LC3的启动子区域抑制细胞内自噬水平。这种现象导致GSK3β的顺序去磷酸化和典型Wnt通路的失活，从而损害C2C12细胞的功能。总之，我们的研究结果表明，缺氧诱导的成肌细胞功能障碍是由于自噬的异常表观遗传学调节，我们的实验证据揭示了慢性缺氧引起的一些肌肉疾病的可能分子发病机制，并提出了一种潜在的治疗选择。

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数字

图1
图1。缺氧时C2C12细胞的特性显著降低。
C2C12细胞在常压或缺氧微环境下培养7天。一使用倒置显微镜观察在这两种条件下生长的C2C12细胞的形态。比例尺：50 微米。b条,c（c）用MTT法测定两种处理下C2C12细胞的活性和增殖(b条)和Edu(c（c）)分析。d日流式细胞术检测两个C2C12细胞的凋亡。e（电子）C2C12细胞在肌源性分化培养基（MD）中在常氧或缺氧微环境下培养7天，并用免疫荧光染色检测MyoG（绿色）/MoD（红色）/细胞核（蓝色）。比例尺：50 微米。（f）用qRT-PCR和western blotting检测C2C12细胞的肌源性基因。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05.c（c）,d日未配对双尾学生的t吨-测试。b条,（f）单因素方差分析
图2
图2。缺氧对C2C12细胞功能受损的影响以表观遗传依赖性的方式发生。
一,b条C2C12细胞分别在正常（P1）和缺氧（Hy）条件下在MD中培养7天，然后在常氧条件下连续传代6次。通过qRT-PCR分析C2C12细胞第2、4和6代中MyoG和MyoD的表达(一)和western印迹(b条).c（c）C2C12细胞在常氧或缺氧条件下培养7天，组蛋白脱乙酰酶家族的表达(HDAC1-11型)用qRT-PCR检测。d日通过蛋白质印迹检测暴露于缺氧刺激后不同时间点的C2C12细胞中HDAC9的表达水平。e（电子）在常氧或缺氧条件下，加或不加NaB治疗（NaB剂量为200 μM）。（f）,克通过蛋白质印迹检测C2C12细胞的不同传代（正常、Hy7d、HyP2、HyP4和HyP6）中HDAC9和H3K9ac的表达水平。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01. 单向方差分析（ANOVA）
图3
图3
抑制剂或siRNA下调HDAC9的表达可以缓解缺氧对C2C12细胞肌生成的抑制作用。 一描述了通过慢病毒载体在C2C12细胞中对HDAC9表达的调节。肌原性诱导后第7天用qRT-PCR和western blotting检测MyoG和MyoD的表达。b条,c（c）为了观察HDAC9对C2C12细胞肌生成的影响，用HDAC抑制剂丁酸钠（NaB）处理C2C12的细胞(b条)或使用HDAC9 siRNA(c（c）). 肌原性诱导7天后，用qRT-PCR和western blotting检测C2C12细胞中MyoG和MyoD的表达水平。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01. 单向方差分析（ANOVA）
图4
图4。HDAC9表观遗传调节C2C12细胞的自噬水平。
一采用western blotting方法检测缺氧7天（含或不含氯喹（CQ））后自噬相关蛋白Beclin1、LC3I/II和特异性货物p62的表达水平。b条将C2C12细胞置于常压或缺氧微环境中培养7天，加入或不加入CQ。用免疫荧光染色法分析C2C12中的LC3（红色）/细胞核（蓝色）。比例尺：50 微米。c（c）为了观察自噬体，C2C12细胞在常压或缺氧条件下培养7天，然后用电子显微镜观察。比例尺：2 微米。d日western blotting检测C2C12细胞Hyp 2、Hyp 4和Hyp 6中自噬相关蛋白的表达水平。e（电子）用NaB和HDAC9 siRNA处理后，通过western blotting检测自噬相关蛋白的表达水平。（f）,克显示有或无CQ的正常毒性C2C12细胞中HDAC9的下调。免疫荧光染色分析C2C12细胞的LC3（红色）/细胞核（蓝色），western blotting分析自噬相关基因。比例尺：50 微米。小时,我从暴露于或未暴露于缺氧的C2C12细胞中分离出染色质，并使用乙酰化组蛋白H3K9（Ac-H3K9）和HDAC9抗体进行染色质免疫沉淀分析。IgG抗体作为对照。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01之间。单向方差分析（ANOVA）
图5
图5。HDAC9可能通过自噬调节C2C12细胞的肌源性分化。
一描述了通过慢病毒载体和siRNA对C2C12细胞中Beclin1表达的调节。用qRT-PCR和western blotting检测肌生成相关基因MyoG和MyoD。b条通过过度表达Beclin1或Rapamycin（Rap）激活缺氧C2C12细胞的自噬后，通过qRT-PCR和western blotting检测肌生成相关基因MyoG和MyoD。c（c）C2C12细胞在MD中培养，并在缺氧条件下用NaB或Beclin1 siRNA处理72 h.通过qRT-PCR和western blotting检测C2C12细胞中的肌生成相关基因MyoG和MyoD。使用去甲氧基C2C12细胞作为对照。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01. 单向方差分析（ANOVA）
图6
图6。自噬通过调节典型Wnt通路调节C2C12细胞的肌源性分化。
一–c（c）免疫荧光染色检测p-GSK3β和活性-β-catenin的表达水平(一)和western印迹(b条)细胞在常氧或缺氧条件下培养72天后 h.通过qRT-PCR分析典型Wnt通路的下游基因(c（c）). 比例尺：50 微米。d日Beclin1下调后，用western blotting检测C2C12细胞中p-GSK3β和活性-β-catenin的表达水平。e（电子）检测了典型Wnt通路的激活48 转染后h进行荧光素酶检测。（f）免疫染色显示，在常氧和缺氧培养72小时的C2C12细胞中，LC3（红色）和p-GSK3β（绿色）重叠 h.比例尺：25 微米。克C2C12细胞在MD中培养并转染对照siRNA或β-catenin siRNA，并使用雷帕霉素激活自噬。72例治疗后用western blotting检测肌生成相关基因 小时。小时用NaB、3-MA和DKK-1处理C2C12细胞。western blotting检测HDAC9、Beclin1和ac-β-catenin的表达水平。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01.c（c）单因素方差分析（ANOVA）。e（电子）未配对双尾学生的t吨-测试
图7
图7。在股动脉结扎模型和动脉硬化闭塞症患者中也观察到HDAC9表观遗传调控的自噬。
我们构建了小鼠单FA结扎模型，并在第21天从对照组和手术组采集样本。一苏木精-伊红染色（h&e）用于观察FA结扎模型小鼠腓肠肌组织。肌肉纤维的定量分析结果如右图所示。比例尺：200 微米。b条,c（c）肌肉重量/胫骨长度之比(b条)和钙蛋白酶表达(c（c）)对照组和结扎组进行分析。d日western blotting检测两组HDAC9和H3K9的表达水平。e（电子）使用抗LC3（红色）和核染色（蓝色，DAPI）对肌肉样本进行免疫染色，以显示自噬水平。LC3定量分析结果+单元格显示在右侧面板中。比例尺：100 微米。（f）显示正常对照组和动脉硬化闭塞症患者的肌肉H&E染色。量化分析的结果显示在右侧面板中。比例尺：200 微米。克免疫组化分析显示LC3（红色）和DAPI（蓝色）在腓肠肌远端的表达。LC3的量化+单元格显示在右侧面板中。比例尺：100 微米。n个 = 8表示鼠标模型和n个 = 2个用于患者。数据表示为平均值 ± 代表性实验中三份样品的标准偏差*对 < 0.05, **对 < 0.01. 未配对双尾学生t吨-测试
图8
图8。示意图描述了缺氧如何调节C2C12细胞的肌源性分化和表观遗传学指导的治疗方法。
在正常氧气存在的情况下，细胞内自噬控制GSK3β的磷酸化，然后促进β-连环蛋白从细胞质转移到细胞核，从而激活肌生成相关基因的表达。低氧条件下，缺氧微环境导致HDAC9表达增加，HDAC9脱乙酰化自噬相关基因H3K9并抑制自噬体形成。自噬不足随后导致GSK3β去磷酸化和典型Wnt通路失活，最终阻止肌源性分化。NaB处理可以部分挽救缺氧引起的C2C12细胞的肌源性分化受损
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