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。2019年4月18日：2019:1484736。
doi:10.1155/2019/1484736。 2019年eCollection。

溴代多巴胺和末端外（BET）蛋白抑制恢复氧化还原平衡并抑制肌成纤维细胞激活

Carmel J W股票 # 1, 查拉兰博斯·迈克洛德斯 # 2, 帕特里夏·利奥尼 # 1, 安德鲁·达勒姆 2, 莎朗·蒙比 2, 阿索尔·U·威尔斯 1, Kian Fan Chung先生 2, 伊恩·阿德科克 2, Elisabetta A Renzoni女士 1, 吉塞拉·林达尔 1
附属机构

溴代多巴胺和末端外（BET）蛋白抑制恢复氧化还原平衡并抑制肌成纤维细胞激活

Carmel J W股票等。 生物识别识别。 。

摘要

背景和目标：进行性肺纤维化是伴有间质性肺病（ILD）的系统性硬化（SSc）患者和特发性肺纤维化（IPF）患者死亡的主要原因。转化生长因子-β（转化生长因子-β)NADPH氧化酶（NOX）衍生的活性氧（ROS）是肺纤维化的驱动因素。我们旨在确定表观遗传读取器、溴代多巴胺和末端外（BET）蛋白在激活的肌成纤维细胞氧化还原平衡调节中的作用。

方法：在TGF中-β-我们通过定量RT-PCR研究了BET抑制剂JQ1对促氧化基因NOX4和抗氧化基因超氧化物歧化酶（SOD2）mRNA表达的影响，通过报告试验研究了抗氧化转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）活性，二氯荧光素染色检测细胞内活性氧水平。肌成纤维细胞活化由α-平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学。通过siRNA沉默和染色质免疫沉淀研究了特定BET蛋白亚型在NOX4基因调控中的作用。

结果和结论：Affymetrix基因阵列分析显示增加氮氧化物4并减资SOD2标准SSc和IPF成纤维细胞中的表达。SOD2标准非ILD对照组成纤维细胞中的沉默诱导了纤维化前表型。转化生长因子-β增加编号4并被抑制SOD2标准表达，同时增加ROS生成和肌成纤维细胞分化。JQ1逆转了TGF-β-调解的氮氧化物4/SOD2标准失衡和Nrf2失活，ROS生成和肌成纤维细胞分化减弱。BET蛋白Brd3和Brd4与氮氧化物4促发剂和驱动TGF-β-诱导的氮氧化物4表达式。我们的数据表明，BET蛋白在促进氧化还原失衡和肺肌成纤维细胞活化方面起着关键作用，并支持BET溴代多巴胺抑制剂作为纤维化肺疾病的潜在治疗手段。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
SOD2-siRNA敲除对α-SMA表达和细胞增殖的影响（a）等级SOD2标准Affymetrix微阵列分析（黑条）确定的基础无血清条件下非ILD对照组（C1-C6）、SSc-ILD（S1-S4）和IPF（U1-U3）肺成纤维细胞中的mRNA通过RT-qPCR（灰条）确认。（b-d）非ILD对照肺成纤维细胞被模拟转染（siRNA–ve）或转染非靶向siRNA（对照siRNA），或SOD2标准-靶向siRNA 72 h之后SOD2标准mRNA和蛋白质（插图）（b）和（c）ACTA2公司测定mRNA表达水平。（d） 用3%FBS孵育24小时诱导增殖 用BrdU掺入法测定h。数据显示为分别在两个对照细胞系（（b）和（c））或一个对照细胞系（d）中进行的三个独立实验的平均值。
图2
图2
JQ1对TGF-β诱导的肌成纤维细胞表型变化和增殖的影响（a）对非ILD对照组成纤维细胞进行24小时的血清饥饿处理 h，预处理500 nM JQ1或JQ1（-）用于2 TGF刺激前h-β1（1ng/ml）用于48 h.细胞染色αSMA（绿色）和核DNA（DAPI/蓝色）。（b） 在无TGF（图A）或有TGF（图片b）的情况下培养细胞-β1对48 用500处理前h nM JQ1（-）（图片C）或JQ1 h.（c）将对照细胞铸入胶原蛋白凝胶中，并用TGF处理-β1和500 nM JQ1（+或-）24 h.释放凝胶并允许收缩4 h、 使用ImageJ测量凝胶面积。数据点是在两个不同细胞系中进行的三次实验的平均值，表示为与JQ1-对照组相比的倍数变化。（d） 对照组成纤维细胞在用3%胎牛血清（FBS）刺激24小时前，进行血清饥饿处理，并用指定浓度的JQ1（+或-）进行预处理 h.通过BrdU掺入测定增殖。数据点是在两个不同细胞系中进行的三次实验的平均值，表示为与JQ1-对照组相比的倍数变化。
图3
图3
JQ1对αSMA和β-actin蛋白表达及细胞内分布的影响.蛋白质表达αSMA（a）和β-48天后通过Western blot分析测定非ILD肺成纤维细胞中的肌动蛋白（b） h是否存在TGF-β1和JQ1（+）或JQ1。F-actin通过在Triton X-100中的差异溶解度从G-actin中分离出来。两个组分的最终体积相同，在SDS-PAGE凝胶上运行的体积相等。的总级别β-还分析了全细胞提取物中的肌动蛋白。图像是三个独立实验的代表。使用ImageJ测量信号强度。条形代表三个独立非ILD控制细胞系的平均值±SD。NS=无显著性。∗p<0.05和∗∗p<0.01。
图4
图4
JQ1对TGF-β诱导的NOX4、SOD2和ACTA2 mRNA表达及细胞内ROS的影响非ILD对照肺成纤维细胞经血清饥饿处理，并用500 nM JQ1（+）或JQ1 TGF刺激前h-β1（1ng/ml）用于进一步24 h.（a）通过RT-qPCR测定NOX4、SOD2和ACTA2 mRNA。（b） 通过6-羧基-2′，7′-二氯二氢荧光素二醋酸盐染色测定细胞内ROS水平。数据表示为与DMSO对照相比的倍数变化，条形图表示在三（a）和四（b）个细胞系中进行的独立实验的平均值±SD。∗p<0.05，∗∗p<0.01，且∗∗∗p<0.001。
图5
图5
JQ1对抗氧化反应元件依赖性转录及Nrf2和Keap1 mRNA表达的影响（a）将非ILD对照成纤维细胞与诱导ARE反应的Firefly-luciferase报告构建物和Renilla-luciferase参考构建物共转染48小时。细胞缺血清24小时 h，预处理500 nM JQ1（+）或JQ1 h，然后用TGF刺激-β24小时1（1ng/ml） h.条形图表示与DMSO控制相比的折叠变化。所示数据点是在两个单独的非ILD对照细胞系中进行的两个独立实验，一式三份，表示为与DMSO（载体对照）相比的平均倍数变化。（b） 细胞缺血清24小时 h，预处理500 nM JQ1（+）或JQ1 TGF刺激前h-β24小时1（1ng/ml） h.通过RT-qPCR测定NRF2和KEAP1 mRNA水平。数据表示为与JQ1对照相比的折叠变化。条形代表三条独立非ILD控制线中独立实验的平均值±SD。∗p<0.05和∗∗p<0.01。
图6
图6
Brd2、Brd3和Brd4在NOX4启动子处的富集及其在TGFβ诱导的NOX4表达中的作用（a）非ILD对照组成纤维细胞饥饿24小时 h，预处理500 nM JQ1（+）或JQ1 TGF刺激前h-β1（1ng/ml）继续4 h.通过ChIP确定Brd2、Brd3和Brd4向NOX4启动子的招募。数据表示为与IgG对照相比的折叠富集。所示数据是在两个对照细胞系中进行的两个独立实验的平均值。（b） 非ILD对照组成纤维细胞被模拟转染（对照组），或转染非特异性siRNA对照组（阴性）或转染特异性siRNA巴西存托凭证3（siBrd3）或巴西雷亚尔4（siBrd4）。转化生长因子刺激细胞-β24的1个 h和的表达式巴西存托凭证3,BRD4、，或氮氧化物4用RT-qPCR测定mRNA水平。数据以四个独立细胞系独立实验的平均值±SEM表示。∗∗p<0.01和∗∗∗p<0.001。
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