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。2019年10月；56(10):7188-7207.
doi:10.1007/s12035-019-1599-x。 Epub 2019年4月17日。

鞘氨醇激酶-1对维持老化视网膜的外/外限制膜和相关粘附连接至关重要

约瑟夫·威尔克森 1 2, 梅根·A·斯蒂尔斯 2 三, 杰米·M·古利 2 三, 理查德·格兰伯格 4, 顾晓武 2 三, 迈克尔·H·埃利奥特 2 三, 理查德·普罗亚 5, 纳瓦杰人A Mandal 6 7 8 9 10 11
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鞘氨醇激酶-1对维持老化视网膜的外/外限制膜和相关粘附连接至关重要

约瑟夫·威尔克森等。 摩尔神经生物醇。 2019年10月。

摘要

鞘氨醇激酶（SPHK1和SPHK2）产生的鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是一种参与细胞增殖和细胞连接形成的信号分子。在本研究中，我们通过电子显微镜和免疫细胞化学对Sphk1基因敲除（KO）小鼠的视网膜进行了表征。我们还测试了培养的Müller胶质细胞对S1P的反应。我们发现S1P在衰老小鼠的视网膜和视网膜色素上皮（RPE）结构完整性中起着重要作用。对15个月龄或中度光应激饲养的Sphk1 KO小鼠视网膜的超微结构分析显示，视网膜外界膜（OLM）退化。该膜由邻近的Müller胶质细胞和感光细胞之间的粘附连接形成。我们还发现，在中度光应激的小鼠中，Sphk1 KO小鼠的视网膜功能降低。体外实验表明，外源性S1P调节了人Müller胶质细胞的细胞骨架重排并增加了N-钙粘蛋白的生成。老年小鼠的RPE也出现了形态学退化，脂质储存空泡增多，吞噬体未消化，这与老年性黄斑变性中的RPE类似。这些发现表明，SPHK1和S1P通过支持粘附连接的形成，在哺乳动物视网膜和视网膜色素上皮的结构维持中发挥着重要作用。

关键词：N-钙粘蛋白；外界膜；视网膜；视网膜变性；鞘氨醇激酶；鞘氨醇-1-磷酸。

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利益冲突声明

利益冲突：作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
鞘氨醇1KO小鼠视网膜的鞘氨醇、神经酰胺和鞘磷脂剖面增加，而循环S1P和dhS1P显著减少。从以5-10 lux饲养的6个月大的小鼠中采集视网膜和血浆，并通过LC/MS分析pmol/mg湿重组织或血浆mL。A） 循环S1P（p＜0.0001）和dhS1P（p＝0.0002）在Sphk1公司KO小鼠。B） 鞘氨醇（Sph，p=0.01）在Sphk1公司KO小鼠视网膜。视网膜组织中的S1P（p=0.0004）和dhS1P（p=0.002）显著降低Sphk1公司KO小鼠。C） 总神经酰胺（Cer，p=0.02）和鞘磷脂（SM，p=0.04）在Sphk1公司KO视网膜。总之，双尾Student t检验，α=0.05，误差条为SEM。
图2。
图2。
Sphk1公司KO导致OLM和感光细胞内外段的结构组织丢失。在光照开始后7-9小时收集视网膜，并通过透射电子显微镜进行分析。A） WT小鼠的视网膜在100-150勒克斯下升高6个月。放大a）显示组成黏附蛋白组成的OLM的宽电子致密带。B） KO小鼠的视网膜在100-150勒克斯下升高6个月。外部线段发生位移（箭头）。放大b）显示OLM的小点状粘连。C） WT小鼠视网膜在5-10勒克斯条件下饲养6个月。放大图c）显示了OLM。D） KO小鼠视网膜在5-10勒克斯条件下饲养6个月。放大d）显示与WT视网膜相当的完整OLM。E） WT小鼠视网膜在5-10勒克斯条件下饲养15个月。放大e）显示15个月大时OLM完整。F） KO小鼠视网膜在5-10勒克斯条件下饲养15个月。视网膜结构变得极为紊乱。内外光感受器节段塌陷，OLM缺失。放大e）显示组成OLM的粘附连接几乎完全消失。对于每个光照条件和时间点，来自n＝3只小鼠的代表性图像。除非另有说明，否则每组的所有比例尺均相同。
图3。
图3。
Sphk1公司KO导致相邻RPE细胞之间脂质储存空泡增加和粘附连接丢失。A） WT小鼠的RPE在100-150勒克斯下饲养6个月。紧密连接（黑色箭头）保持完整，沿着细胞体的粘附连接（白色箭头）也保持完整。B） RPE来自Sphk1公司KO小鼠以100-150勒克斯的亮度饲养6个月。紧密连接（黑色箭头）和粘附连接（白色箭头）保持完好。然而，这些细胞中含有脂质的液泡（星号）明显增多。还观察到电子密度的多泡吞噬体增加（黑箭头）。WT（C）和KO（D）小鼠的C和D）RPE在5-10勒克斯下饲养6个月。两种基因型的RPE形态相似，紧密连接（黑色箭头）或粘连连接（白色箭头）没有变化。E） WT小鼠的RPE在5-10 lux的浓度下持续15个月。粘附连接保持完好。可以观察到脂质储存囊泡，但与KO小鼠相比，其数量较少（星号）。F） KO小鼠的RPE在5-10勒克斯的条件下持续15个月。RPE细胞之间仍存在紧密连接（黑色箭头），但粘附连接丢失，导致RPE细胞间出现较大的膜填充间隙（）。在整个RPE中观察到电子致密的吞噬体（黑箭头）。RPE的基底膜内陷也被高度破坏，导致细胞内出现巨大的开放的膜充满的液泡。来自n=3只小鼠的代表性图像。除非另有说明，否则每行的所有比例尺都相同。
图4。
图4。
OLM和RPE中粘附分子连接的损失是特定的鞘氨醇1KO与否Sphk2公司让开。用电子显微镜比较WT，Sphk1公司KO和Sphk2公司C57B/6J背景下1岁小鼠的KO小鼠视网膜和RPE。A-i）WT小鼠视网膜显示出光感受器的有结构的内部和外部片段。白色箭头表示OLM。A-ii）OLM增大显示WT小鼠中广泛的电子致密粘附物接触（白色箭头）。A-iii）RPE具有完整的紧密连接（黑色箭头）和粘附物连接（白色箭头）。B-i和-ii）Sphk1公司KO小鼠视网膜的光感受器紊乱始于内节的塌陷。OLM有粘附连接的丢失和膜的全部丢失。与WT OLM相比，电子致密粘附连接（白色箭头）为短点状连接。B-iii）RPE具有正常紧密连接（黑色箭头）。仍有一些粘附连接（白色箭头）。然而，在RPE细胞（双匕首）之间观察到这些连接退化。观察到这些区域是两个细胞之间的巨大开放空间，充满了膜碎片。B-iv）Sphk1公司KO小鼠RPE细胞吞噬体也增加（星号）。扩大表明这些吞噬体充满了未消化的膜。C-i和-ii）Sphk2公司KO小鼠RPE具有与WT小鼠视网膜相似的表型。C-iii）Sphk2公司KO小鼠RPE接近WT RPE。紧密连接（黑色箭头）表示两个RPE细胞的边界，粘附连接（白色箭头）可以追踪细胞的长度。来自n=3只小鼠的代表性图像。除非另有说明，否则每列的所有比例尺都相同。
图5。
图5。
血管粘附连接和新生血管潜能不受Sphk1公司.A）WT的平板安装视网膜（A-d）和Sphk1公司对KO（e-h）小鼠进行周细胞覆盖率（a和e）、小动脉平滑肌细胞覆盖度（b和f）以及内皮细胞（c和g）的检测。未观察到差异。B） 早产儿新生血管模型视网膜病变在WT和鞘氨醇1KO小鼠视网膜。以灰色突出显示的区域有高密度的NV簇，这些簇是在小鼠恢复常压5天后对缺氧环境作出反应而形成的。C） ROP后NV簇毛区域的量化显示，两组之间的NV无显著差异鞘氨醇1KO或WT（n=7，双尾学生t检验，α=0.05，误差条为SD）。
图6。
图6。
Sphk1公司KO小鼠视网膜显示OLM处N-钙粘蛋白丢失。A） 用花生凝集素（PNA，红色）对在5-10勒克斯和100-150勒克斯光照条件下饲养的WT和KO小鼠的视网膜进行锥体外鞘染色，WT和GO小鼠之间的视网膜无变化。WT和KO小鼠的视网膜也进行了N-Cadherin染色。OLM的KO视网膜中可以看到N-Cadhein覆盖的间隙。B） 在5-10勒克斯的饲养条件下，15个月大的小鼠OLM处N-cadherin染色的放大倍数（2倍缩放）。KO小鼠OLM处N-cadherin（白色箭头）的正常连续覆盖显著减少。C） 视网膜对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）进行染色以检测Müller细胞的胶质激活，结果表明它们没有被激活，因此不是OLM丢失的原因。D） Müller胶质细胞谷氨酰胺合成酶（GS）染色显示，Müllar胶质细胞数量没有全部损失，但可以检测到顶端染色的损失。E） 2倍放大构成OLM的顶端Müller足，发现染色消失，绒毛结构伸入内节Sphk1公司KO小鼠。F） 构成内界膜的Müller胶质细胞的基底端足在KO小鼠视网膜中未受影响。来自n=3只小鼠的代表性图像。
图7。
图7。
WT和ONL的Scotopic ERG和ONL量化Sphk1公司KO小鼠。在0.0004、0.004、4、400和2000 cd.sec/m强度的五次闪光刺激下，记录暗视功能的ERG反应2.A-D）在100-150勒克斯的光照条件下饲养的动物。A） 3月龄WT和KO小鼠的A波反应升高（WT n=11，KO n=13；*p=0.03；**p=0.008）。B） 3月龄小鼠的B波反应（WT n=11，KO n=13 B；*p=0.007）。C） 6月龄动物的A波反应（WT n=9，KO n=10，*p=0.03）。D） 6个月大动物的B波反应（A-D:WT n=9，KO n=10.）E-H）在5-10勒克斯光照条件下饲养的动物。E） 在昏暗光线下饲养的3个月大小鼠的A波反应。F） 在昏暗光线下饲养的3个月大小鼠的B波反应。G） 在昏暗光线下饲养的6个月大小鼠的A波反应。H） 在昏暗光线下饲养的6个月大小鼠的B波反应（E-H n=5）。多重比较的双向方差分析和Bonferroni校正，α=0.05。所有误差条均为SEM。
图8。
图8。
人类培养的Müller glia（MIO-M1）细胞通过增加肌动蛋白组装和增加N-钙粘蛋白的生成对S1P作出反应。A） 用0.5μM S1P和BSA处理的MIO-M1细胞作为对照。治疗30分钟后，S1P增加细胞大小和肌动蛋白组装。B） 处理4小时后，BSA处理的细胞保持细长，相邻细胞之间有小接触，而S1P处理的细胞与其他细胞有广泛接触。n=3个重复的代表性图像。C） S1P处理12小时后，MIO-M1细胞中的N-钙粘蛋白增加。n=3个重复的代表性图像。D） MIO-M1细胞的结构光照显微镜显示，S1P处理的细胞中N-cadherin点增加。S1P处理的细胞绒毛肌动蛋白阳性突起增加。S1P处理细胞中肌动蛋白阳性突起用N-钙粘蛋白点状物（箭头）装饰，如下图所示。在BSA处理的细胞中未发现N-钙粘蛋白修饰。n=3个重复的代表性图像。E） MIO-M1细胞的Western blot检测N-钙粘蛋白。用1 uM S1P治疗12小时后，N-钙粘素显著增加（3次重复，归一化为波形蛋白负荷控制，双尾Student t检验，α=0.05，p=0.02，误差条SD）。
图9。
图9。
S1P激活MIO-M1细胞中的RAC1和CDC42。MIO-M1细胞用0.5μM S1P或等效体积的BSA处理并孵育12小时。使用PAK1-糖粒在MIO-M1细胞上进行GTP结合RAC1和CDC42的免疫沉淀。然后通过RAC1和CDC42的western blot分析这些下拉。A） 印迹显示GDP阴性对照、GTP阳性对照和治疗后RAC1的谱带。FIJI中带强度的量化显示，S1P处理显著增加MIO-M1细胞中激活的RAC1（在同一个印迹上重复2次进行量化，双尾Student t检验，α=0.05，p=0.04，误差条SD）。B） 在S1P处理的细胞中检测到活性CDC42水平增加。斑点显示GDP阴性对照、GTP阳性对照和CDC42条带。FIJI的谱带强度表明，S1P处理增加了MIO-M1细胞（2个重复）中激活的Rac1。C） 在DMSO（载体对照）或RAC1/CDC42抑制剂ML141的存在下，用对照BSA或0.5μM S1P处理MIO-M1细胞。二甲基亚砜存在下的S1P导致肌动蛋白组装和N-钙粘蛋白染色增加。然而，在ML141存在下，S1P导致肌动蛋白组装和N-钙粘蛋白生成的损失，产生类似BSA处理细胞的细胞。n=3个重复的代表性图像。
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