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.2019年7月；176(13):2209-2226.
doi:10.1111/bph.14667。 Epub 2019年5月17日。

抑制磷酸二酯酶-4通过干扰黏膜免疫减轻小鼠溃疡性结肠炎

Heng Li（李恒） 1 2, 陈凡 1, 冯春兰 1, 吴彦伟（Yanwei Wu） 1, 惠民路 1 2, 何培兰 三, 杨晓倩 三, 朱凤华 三, 青旗 1, 高元卓 1 2, 左建平 2 三, 魏棠 1 2
附属公司

抑制磷酸二酯酶-4通过干扰黏膜免疫减轻小鼠溃疡性结肠炎

Heng Li（李恒）等。 杂志. 2019年7月.

摘要

背景和目的：溃疡性结肠炎（UC）是一种病因难治的炎症性疾病，伴有上皮屏障功能障碍和肠道炎症。磷酸二酯酶-4（PDE4）是一种细胞内促炎酶，可水解和灭活cAMP。尽管PDE4抑制剂已被批准用于肺部和皮肤病，但PDE4抑制剂在调节肠道粘膜免疫中的作用仍不明确。本研究旨在探讨停搏酶抑制PDE4对右旋糖酐硫酸钠诱导的小鼠UC是否具有保护作用。

实验方法：通过形态学、组织病理学和生化分析以及体内成像评估肠道炎症和疾病严重程度。使用定量实时PCR、ELISA、Luminex分析、免疫染色或western blotting，以及siRNA敲除，测定结肠和巨噬细胞中炎症介质、PDE4介导通路成分的表达。流式细胞术分析肠系膜淋巴结和结肠固有层的免疫细胞。

关键成果：抑肽酶可减弱UC的临床特征，抑制结肠镜下损伤、炎症介质的产生、氧化应激和纤维化。抑肽酶还通过降低趋化因子和趋化因子受体的表达，促进上皮屏障功能，抑制免疫细胞浸润炎症组织。此外，在UC中，PDE4A、PDE4B和PDE4D在结肠中高度表达。单体不仅抑制PDE4亚型的表达，还激活PKA-CREB和Epac-Rap1通路，随后抑制MAPK、NF-κB、PI3K-mTOR和JAK-STAT-SOCS3的激活。

结论和启示：停搏液对PDE4的抑制通过干扰粘膜免疫保护UC。这些发现为调节肠道炎症提供了一种有希望的策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
Apremiplast改善了DSS诱导的结肠炎小鼠炎症和氧化应激。用3%的DSS建立小鼠结肠炎模型7天，然后饮用水4天。（a） 以初始体重百分比表示的体重和根据表1所述标准分配的疾病活动指数（DAI）平均值。（b） 脾脏指数以脾脏重量（mg）/体重（g）计算。（c） 结肠长度。（d） 典型的结肠图像。（e） 血清生化指标，包括ALB、ALP、TG和TC。（f）血清细胞因子分泌。（g） 分配组织学分数。（h） 用苏木精和伊红染色的结肠粘膜代表性组织切片（放大20倍和40倍）。（i） 血清MPO、SOD和MDA。（j） 结肠MPO、SOD和MDA。（k） 脾和肠系膜淋巴结细胞ROS生成的流式细胞术分析和量化。所示数据为平均值±SEM；n个=每组8只小鼠*P（P）<0.05，与车辆（仅DSS）组有显著差异
图2
图2
抑肽酶抑制结肠炎小鼠炎症介质的产生和结肠纤维化。（a） 全厚结肠培养中细胞因子的产生情况。（b） 组织匀浆中细胞因子的蛋白质水平。（c） 结肠中细胞因子的mRNA表达。（d） iNOS和COX-2在结肠中的mRNA表达。（e） 结肠炎症小体相关基因的mRNA表达。（f） 用Masson染色（100倍放大）对结肠粘膜的代表性切片和阳性面积（%）进行定量。（g） 结肠纤维化相关基因的mRNA表达。所示数据为平均值±SEM；n个=每组8只小鼠*P（P）<0.05，与车辆（仅DSS）组显著不同
图3
图3
抑肽酶保护肠上皮屏障功能，防止细胞因子诱导的上皮屏障破坏。（a） 在异氟醚麻醉下，使用IVIS光谱CT系统获得L‐012钠的生物发光成像。（b） 使用FITC-右旋糖酐进行荧光成像（左），并测量FITC-左旋糖酐的血清荧光强度（右）。（c） western blot和α-tubulin检测到的紧密连接相关蛋白（ZO‐1、E‐钙粘蛋白和闭塞素）的表达被用作负荷对照。（d） 结肠组织进行ZO‐1和E‐cadherin免疫荧光染色，细胞核进行DAPI染色。（e） 紧密连接相关蛋白的mRNA水平。（f） MMP2、MMP3和MMP9的mRNA表达。（g） 在以TNF-α和IFN-γ为底物的Caco‐2细胞单层中，屏障功能以TEER的形式进行测量。（h） 细胞因子诱导的Caco‐2细胞中FITC‐右旋糖酐的通透性。（i） Caco‐2细胞中ZO‐1荧光强度的定量。（j） Caco‐2细胞中ZO‐1免疫荧光染色的代表性图像。所示数据为平均值±SEM。（a–f），n个=每组8人*P（P）<0.05，与车辆（仅DSS）组有显著差异。（g–j），n个 = 5. *P（P）<0.05，与TNF‐α+IFN‐γ治疗组有显著差异
图4
图4
抑肽酶通过抑制趋化因子及其受体的表达来调节肠系膜淋巴结和固有层的白细胞数量。（a） 巨噬细胞百分比（CD11b+80层/四层+)中性粒细胞（CD11b+等级-1+)和树突状细胞（CD11b+CD11c公司+)在MLN中。（b） 原始T细胞（CD44）的百分比−CD62L型+，位于CD3上+CD4细胞+)，效应T细胞（CD44+CD62L型−，CD3门控+CD4细胞+)、Th17细胞（CD4+IL‐17号+，位于CD3上+)和Treg细胞（CD25+Foxp3系列+，CD3门控+CD4细胞+)在MLN中。（c） CD11b的百分比+固有层中的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞。（d）γδTCR的百分比+T细胞，CD4+T细胞和CD8+固有层T细胞。（e）结肠组织用CD11b、F4/80和Ly6G进行免疫荧光染色，细胞核用DAPI染色。（f） 结肠组织进行CXCR3和CCR5免疫荧光染色。（g） 结肠组织中趋化因子和受体的mRNA表达。数据显示为流式细胞术和免疫荧光染色下的代表性图像。汇总数据显示为平均值±SEM；n个=每组8人*P（P）<0.05，与车辆（仅DSS）组显著不同
图5
图5
四月体在体外刺激下抑制淋巴细胞增殖和细胞因子的产生。CD4细胞+从MLN中纯化T细胞，并用抗CD3和抗CD28抗体处理以测定CD4+T细胞增殖（a）和（b）细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A）的产生。（c） 用抗CD3抗体处理的MLN细胞的增殖。测定细胞因子产生量（d）。（e） LPS处理的MLN细胞的增殖和（f）细胞因子的产生。所示数据为平均值±SEM；n个=每组8只小鼠*P（P）<0.05，与车辆（仅DSS）组显著不同
图6
图6
抑肽酶抑制PDE4表达，激活PKA–CREB和Epac‐Rap1信号，随后干扰JAK–STAT–SOCS3、PI3K–mTOR、NF‐κB和MAPK通路。（a） 结肠组织中PDE4亚型的mRNA表达。（b） PDE4和PKA–CREB信号相关蛋白亚型的表达。（c） 结肠组织PDE4D、p‐p65和p‐REK的免疫组织化学染色。（d） 结肠组织中Epac1的免疫荧光染色。JAK–STAT–SOCS3信号（e）、NF‐κB‐和MAPK介导的信号（f）和PI3K–mTOR信号（g）的Western blot分析。显示的数据是来自蛋白质印迹分析和免疫组织化学染色的代表性图像。汇总数据显示为平均值±SEM；n个=每组8人*P（P）<0.05，与车辆（仅DSS）组显著不同
图7
图7
抑肽酶通过PKA–CREB信号抑制巨噬细胞的炎症反应。（a） LPS刺激的BMDM和RAW264.7细胞中TNF-α和IL-10的生成。（b） 通过western blot测定停搏后CREB和ATF‐1的磷酸化。（c） 停搏治疗后磷酸化CREB的免疫荧光染色。用10μM apremilast、10μM H89（PKA抑制剂）和10μM Forskolin处理BMDM和RAW264.7细胞，测量cAMP水平（d）、CREB磷酸化和ATF‐1（上e、上f和g），并在LPS刺激（h）时测定TNF‐α的生成。用PKA siRNA和NC siRNA转染BMDMs和RAW264.7细胞；然后用apremilast、H89和forskolin处理细胞。测定CREB和ATF‐1（e的下部；f的下部）和TNF‐α（i）的磷酸化。总结数据显示为三个独立实验的平均值±SEM
图8
图8
DSS诱导的小鼠UC模型中的粘膜免疫如何受到停搏剂的影响以减弱小鼠UC的图表。PAMP，病原体相关分子模式；DAMP，损伤相关分子模式
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