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.2019年2月13日；16(1):35.
doi:10.1186/s12974-019-1429-0。

中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF）通过减轻Aβ诱导的内质网应激来对抗Aβ毒性

徐胜春 1, 泽民帝 1 2 3, 何玉凤 1 2 3, 王润杰 1 2 3, 马宇阳 1 2 3, 孙睿（Rui Sun） 1 2, 李静（音译） 1 2, 王涛（音译） 1, 沈玉君 1 2 3, 盛运芳 1 2 4, 冯丽杰 5 6 7, 沈玉仙 8 9 10
附属公司

中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF）通过减轻Aβ诱导的内质网应激来对抗Aβ毒性

徐胜春等。 J神经炎症. .

摘要

背景：淀粉样β肽（Aβ）的细胞外积聚是阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一，并导致神经元的丢失。中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子（MANF）是内质网应激诱导的神经营养因子。包括我们在内的许多小组已经证明，MANF可以挽救几种神经疾病中的神经元损失，如帕金森病和脑缺血。然而，MANF是否对AD的Aβ神经毒性有保护作用尚不清楚。

方法：在本研究中，MANF在Aβ中的特征表达1-42-通过免疫荧光染色、qPCR和Western blot分析处理后的神经细胞以及APP/PS1转基因小鼠大脑中的神经细胞。在Aβ1-42还调查了接触情况。

结果：结果表明，APP/PS1转基因小鼠和Aβ1-42-处理过的神经元细胞。MANF过表达或rhMANF治疗对Aβ有部分保护作用1-42-诱导神经元细胞死亡，与裂解的caspase-3显著减少相关，而MANF敲除siRNA加重了Aβ1-42细胞毒性包括caspase-3激活。进一步研究表明，Aβ1-42暴露，而MANF的击倒具有相反的效果。

结论：这些发现表明，MANF可能通过减轻内质网应激对Aβ诱导的神经毒性发挥神经保护作用，表明MANF作为AD治疗候选药物的适用性。

关键词：阿尔茨海默病；细胞凋亡；内质网应激；MANF；β-淀粉样蛋白。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德批准和参与同意

所有的努力都是为了尽量减少怀孕大鼠的数量和他们的痛苦。这些程序得到了安徽医科大学动物护理和动物使用伦理委员会的批准。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
图1
Aβ1–42降低人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞活力并诱导细胞凋亡。MTT分析显示aβ后SH-SY5Y细胞的活性显著下降1–42剂量照射(一)与时间相关(b条)方式*P（P） < 0.05, **P（P） < 与对照组相比为0.01。c（c）SH-SY5Y细胞与含有10%FBS的DMEM、无血清DMEM或含有不同浓度Aβ1–42（5、10、20和40μM）分别持续24小时。通过TUNEL染色（绿色）检测凋亡细胞。DAPI用于测定粗核数。比例尺=50 微米。d日TUNEL阳性细胞数量的定量分析c（c）. *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01，与无血清组相比。e（电子）利用Annexin V/PI染色进行的FACS分析显示，不同浓度的Aβ处理后SH-SY5Y细胞凋亡增加1–42与无血清组比较24h。（f）对大肠杆菌中凋亡细胞数量的定量分析*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01，与无血清组相比。所有定量数据均表示为平均值 ± 至少三个独立实验的SD。秒（−）无血清，反对的论点控制
图2
图2
Aβ1–42诱导SH-SY5Y细胞内质网应激和MANF表达上调。一SH-SY5Y细胞与含有10%FBS的DMEM、无血清DMEM和含有Aβ1–42（10μM）持续24小时，或含DMEM的衣霉素（TM）（2.5μg/ml）持续12小时。细胞核用DAPI（蓝色）染色。放大的图像分别显示了MANF和BiP的表达和细胞分布。比例尺=10 微米。b条与10%FBS、无血清DMEM和含有Aβ的DMEM孵育的SH-SY5Y细胞的MANF（红色）和CHOP（绿色）免疫荧光标记的代表性图像1–42（10μM）持续24小时，或含有TM（2.5μg/ml）的DMEM持续12小时。放大后的图像分别显示MANF和CHOP的表达和细胞分布。比例尺=10 微米。c（c）定量MANF公司,商业保险、和CHOP公司含有10%FBS的DMEM、无血清DMEM和含有Aβ1–42（10μM）持续24小时，或含有TM（2.5μg/ml）的DMEM持续12小时。GAPDH公司用作对照。d日如图所示处理的SH-SY5Y细胞中MANF、BiP、CHOP和裂解的胱天蛋白酶-3的蛋白水平。α-微管蛋白作为负荷对照。e（电子）通过密度测定法对d中归一化为α-微管蛋白的蛋白质水平进行定量。所有定量数据均以平均值表示 ± 至少三个独立实验的SD*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.C类-半胱氨酸天冬氨酸酶-3裂解半胱天冬酶-3，TM（TM）衣霉素
图3
图3
APP/PS1转基因小鼠大脑中MANF的表达。6月龄WT小鼠（a，c）和APP/PS1小鼠（b，d）海马（a，b）和皮层（c，d）MANF的DAB染色。注意到与WT小鼠（a1，c1）相比，APP/PS1小鼠（b1，d1）大脑中MANF表达上调。面板a2和c2分别是a1和c1中的放大图像。面板b2、b3和面板d2、d3分别是b1和d1的放大图像（红色箭头所示），以显示海马和皮层中MANF的细胞分布。比例尺=100μm（a–d）或20μm（a1、a2、b1、b2、b3、c1、c2、d1、d2和d3）。（e） 4个月龄和6个月龄雄性APP/PS1小鼠以及年龄和性别匹配的野生型（WT）小鼠的海马和皮层中MANF的水平。右侧面板显示了MANF水平的定量分析。数据以平均值表示 ± SD，每组使用四只小鼠*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01. （f） APP/PS1转基因小鼠大脑皮层中MANF（红色）和NeuN（绿色）免疫荧光标记的代表性图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（g） f中的放大图像显示MANF和NeuN的共定位。比例尺=10μm。M（M）月，重量野生型
图4
图4
MANF对Aβ有保护作用1–42-诱导的细胞毒性。一转染MANF-Flag质粒或MANF-siRNA的N2a细胞中MANF水平。b条MANF过度表达增加Aβ细胞的活性1–42-处理细胞与pcDNA3.1载体转染细胞进行比较。用pcDNA3.1载体或MANF-Flag质粒转染N2a细胞。转染后24小时，用Aβ处理细胞1–42（10μM），用于指定的时间，并用于MTT分析*P（P） < 0.05，与相应时间点的载体转染细胞相比。c（c）内源性MANF敲除对Aβ易损性的影响1–42（10μM）对N2a细胞的细胞毒性。用NC-siRNA或有效的MANF-siRNA转染N2a细胞。转染后24小时，用Aβ处理细胞1–42（10μM），用于指定的时间，并用于MTT分析*P（P） < 0.05，与相应时间点的NC-siRNA-转染细胞相比。d日MANF对Aβ诱导的细胞凋亡的影响1–42N2a细胞瞬时转染MANF-Flag或MANF-siRNA，然后用Aβ1–42（10μM）再持续24小时。TUNEL染色检测凋亡细胞。细胞核用DAPI染色。比例尺=100μm。e（电子）TUNEL阳性细胞数量的定量分析d日从每组四个部分的五个随机选择的区域中对TUNEL阳性细胞进行计数*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01.（f）在Aβ中测定CHOP和裂解caspase-3的蛋白水平1–42-用MANF-Flag或MANF-siRNA转染处理过的N2a细胞。GAPDH作为负荷对照。所有定量数据均表示为平均值 ± 来自三个独立实验的SD
图5
图5
重组人MANF蛋白（rhMANF）对Aβ的保护作用1–42-诱导细胞毒性。一在Aβ存在下rhMANF对细胞活力的剂量依赖性影响1–42暴露。在Aβ1–42（10μM）处理额外24小时，并处理用于MTT分析*P（P） < 0.05，与仅用Aβ处理的细胞相比1–42.b条在Aβ存在下rhMANF对细胞活性的影响1–42SH-SY5Y在Aβ1–42（10μM）处理指定时间并处理用于MTT分析*P（P） < 0.05，与仅Aβ相比1–42-在指定的时间点处理细胞。c（c）用Aβ1–42（10μM），使用或不使用rhMANF 24小时。GAPDH被用作负荷控制。d日指示蛋白质的密度定量标准化为c*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01，与仅用Aβ处理的细胞相比1–42.#P（P） < 0.05,##P（P） < 0.01,###P（P） < 0.001，与对照组比较。所有定量数据均表示为平均值+至少三个独立实验的SD。C类-半胱氨酸天冬氨酸酶-3裂解半胱天冬酶-3
图6
图6
MANF对Aβ有保护作用1–42通过抑制内质网应激产生毒性。一MANF过度表达对Aβ中BiP、ATF6、磷酸化IRE1、XBP1s、磷酸化eIF2α、ATF4、CHOP和裂解caspase-3水平的影响1–42-处理过的细胞。在Aβ前用pcDNA3.1-MANF-Flag质粒及其空载体转染N2a细胞1–42（10μM）处理24小时或TM（2.5μg/ml）处理12小时并处理WB。b条MANF敲除对Aβ中BiP、ATF6、磷酸化IRE1、XBP1s、磷酸化eIF2α、ATF4、CHOP和裂解caspase-3水平的影响1–42-处理过的细胞。在Aβ前用NC-siRNA或MANF-siRNA转染N2a细胞1–42（10μM）处理24小时或TM（2.5μg/ml）处理12小时，然后处理WB。c（c）α-微管蛋白标准化蛋白定量。d日标准化α-微管蛋白水平的蛋白质定量b条.所有定量数据均表示为平均值 ± 至少三个独立实验的SD*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.01.TM（TM）衣霉素，C类-半胱氨酸天冬氨酸酶-3裂解半胱天冬酶-3
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