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.2019年5月；137(5):801-823.
doi:10.1007/s00401-019-01967-4。 Epub 2019年2月7日。

顶叶皮层微血管提取物中β-淀粉样蛋白的病理变化：与脑淀粉样血管病和阿尔茨海默病的关系

菲利普·布拉萨 1 2, 辛迪娅·特伦布雷 2, 朱莉·施耐德 三, 大卫·A·贝内特 三, 油炸Calon 4 5
附属公司

顶叶皮层微血管提取物中β-淀粉样蛋白的病理变化：与脑淀粉样血管病和阿尔茨海默病的关系

菲利普·布拉萨等。 神经病理学学报. 2019年5月.

摘要

一些证据表明，血脑屏障（BBB）功能障碍与阿尔茨海默病（AD）的病理生理学有关，例如频繁发生脑淀粉样血管病（CAA）和Aβ肽清除缺陷。然而，脑微血管细胞在这些异常中的具体作用仍不明确。在这项研究中，我们通过Western、ELISA和免疫荧光分析验证了一种从人类大脑皮层冷冻样品中生成富含微血管的部分的程序。然后，我们研究了宗教秩序研究中60名志愿者顶叶皮层产生的微血管提取物中的Aβ及其清除或生成相关蛋白。根据修订的AD神经病理学诊断指南中提出的ABC评分法，志愿者被分为AD组（n=38）或对照组（n=22）。在神经病理学诊断为AD的患者中，ELISA测定的血管Aβ40和Aβ42浓度较高，在载脂蛋白E4携带者和晚期实质性CAA患者中，与各自年龄匹配的对照组进行比较。参与Aβ清除的两种蛋白ABCB1和neprilysin在AD患者中的血管水平较低，与认知功能呈正相关，而与血管Aβ40呈负相关。相反，在AD患者和载脂蛋白E4携带者中，产生aβ所需的BACE1蛋白增加，与认知功能呈负相关，与微血管提取物中的aβ40呈正相关。本报告表明，从冷冻人脑样本中浓缩微血管有助于定量生化分析中枢神经系统疾病中的脑血管功能障碍。总体数据显示，从患有实质性CAA-AD的个体中提取的微血管含有较多的Aβ和BACE1，而较少的ABCB1和neprilysin，这表明脑微血管细胞的功能障碍模式与CAA和AD的病理和症状有关。

关键词：阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白；血脑屏障；脑微血管细胞；脑淀粉样血管病。

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利益冲突声明

利益冲突：作者声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1
验证我们的微血管富集方案。a） 将富含微血管和缺乏微血管的实质部分（在过滤方案中分别以绿色和红色表示）从大脑皮层的整体匀浆中分离出来的工作流程，以及随后的步骤，这些步骤允许进行Western blot、ELISA和免疫荧光实验。b） 微血管提取物显示内皮标记物（如克劳丁-5、闭塞素、CD31/PECAM和ABCB1/P-糖蛋白）以及壁细胞标记物PDGFRβ和α-SMA富集，而突触素和NeuN这两种神经标记物在微血管衰竭的实质部分富集。所有样本均来自冷冻的顶叶皮质块。所有具有代表性的照片示例都采用了连续带。每个样品装载相同数量（8μg）的蛋白质。c-f）免疫荧光验证表明，与微血管缺失的实质部分（面板d）相比，基底膜（绿色）标记物IV型胶原染色的微血管集中在血管部分（面板c）。相反，两个组分的神经元细胞核（NeuN，红色）的免疫染色显示，神经元主要存在于微血管缺失的实质组分中（图d）。IV型胶原阳性微血管也被claudin-5（e组）、ABCB1（f组）、PDGFRβ（g组）和α-SMA（h组）抗体染色。使用的放大倍数：20倍。比例尺：20μm。缩写：P，微血管衰竭的实质部分；T、 总匀浆；Va，血管分数，富含微血管；WB、Western印迹
图2
图2
顶叶皮层微血管提取物中Aβ肽的定位。a） 用ELISA法测定脑微血管提取物中aβ40、aβ42和aβ40/aβ42比值的浓度。与来自相同顶叶皮层样品的全匀浆相比，脑微血管提取物中的Aβ40/Aβ42比率高出3倍。数据表示为平均值±标准误差。图形栏中显示了样本大小。统计分析：未配对学生的t检验。**p<0.01。b-d）甲酸预处理后Aβ40和Aβ42的免疫标记显示，这两种肽在顶叶皮层第4阶段薄壁CAA的大血管上积聚，而在第0阶段薄壁CAA中未观察到免疫反应。值得注意的是，对于这两个阶段，在较小的毛细血管中均未发现信号。使用的放大倍数：20倍。比例尺：20μm
图3
图3
AD患者和apoE4携带者脑微血管中Aβ40和Aβ42的浓度增加。用ELISA法测定脑微血管提取物中Aβ40、Aβ42和Aβ40/Aβ42比值的浓度。a-c）参与者根据其基于ABC标准的神经病理学诊断进行分组；d-f）他们的临床诊断和j-l）他们的apoE4等位基因携带。我们观察到神经病理学诊断为AD的个体（A，b）和载脂蛋白E4携带者（j，k）中的Aβ浓度增加。对于所有组，Aβ40/Aβ42比率（c、f和l）没有发现显著变化。数据经过对数变换进行统计分析，并用对数标度的散点图表示。水平条表示平均值±S.E.M.统计分析：Mann-Whitney检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.0001。相关分析表明，微血管提取物中的Aβ40和Aβ42水平均与视觉空间能力得分（g，h）呈负相关。统计分析：皮尔逊相关系数。¶p<0.05。缩写：AD、阿尔茨海默病；MCI，轻度认知障碍；NCI，健康对照组，无认知障碍
图4
图4
在顶叶皮质实质CAA分期较高的参与者中，脑微血管中的Aβ40和Aβ42浓度升高。用ELISA法测定脑微血管提取物中Aβ40、Aβ42和Aβ40/Aβ42比值的浓度。a-c）受试者根据顶叶皮质的实质CAA分期分为：0，无沉积；1、零星的节段性沉积，但不是环向沉积；2、环向沉积最多10个容器；3、周向沉积高达75%的区域；4，环向沉积超过总区域的75%。将阶段3和阶段4合并在一起进行统计分析。第3和第4期实质性CAA患者的Aβ42浓度升高（b组），而同一组（A组）的Aβ40浓度仅呈上升趋势。统计分析：Kruskal-Wallis非参数单向方差分析，然后进行Dunn的事后检验。$$p<0.01。d-f）根据其ABC神经病理学诊断对个体进行分组，并根据是否存在实质性CAA进行细分，无论其严重程度如何。AD的神经病理诊断与较高的Aβ40和Aβ42血管浓度相关（图d和图e），而实质CAA仅与Aβ42水平升高相关（图e）。AD和实质性CAA患者的Aβ40浓度最高。统计分析：Kruskal-Wallis非参数单向方差分析，然后进行Dunn的事后检验p<0.05，$$$p<0.001，$$$p<0.0001和双向方差分析，然后进行Bonferroni的事后检验p<0.05。数据经过对数变换进行统计分析，并用对数标度的散点图表示。水平条表示平均值±S.E.M.缩写：pCAA，实质CAA
图5
图5
Aβ流出转运蛋白ABCB1在AD患者的血管部分减少。通过Western blot测定微血管提取物中的ABCB1（p-糖蛋白）、LRP1和RAGE水平。使用亲环素B对数据进行标准化。ABCB1、LRP1和RAGE的代表性免疫印迹示例（面板a、h和m）。以随机顺序加载的所有样品在相同的免疫印迹实验中进行定量。显示了连续的频带。当参与者根据其AD神经病理学诊断进行分组时，没有发现差异（面板b、i和n）。当根据临床诊断对个体进行分组时，发现AD患者的ABCB1显著降低，而LRP1和RAGE无差异（面板c、j和o）。统计分析：Kruskal-Wallis单向方差分析，然后进行Dunn的事后检验p<0.05，$$p<0.01。微血管提取物中ABCB1水平与整体认知和情景记忆呈正相关（面板d和e）。在微血管提取物中，在所研究的转运体中，只有ABCB1水平与Aβ40含量呈负相关（面板f）。微血管提取物中的Aβ42浓度与所研究的任何转运体之间均未观察到显著相关性（图g、图1和图q）。统计分析：皮尔逊相关系数。¶p<0.05，¶p<0.01。缩写：A/AD，阿尔茨海默病；ABC Dx，ABC神经病理学诊断；C、 控制；临床Dx，临床诊断；cypB，亲环素B；M/MCI，轻度认知障碍；N/NCI，健康对照，无认知障碍；ROD，相对光密度
图6
图6
AD患者脑微血管中的肾素水平降低，并与认知功能和Aβ40相关。Western blot检测微血管提取物中的肾素水平。使用亲环素B对数据进行标准化处理。当参与者根据其AD神经病理学评估进行分组时，未发现差异（a组），而根据临床诊断，AD患者的数据显著减少（B组）。按照随机顺序装载所有样本，并进行相同的免疫印迹实验。显示了连续的频带。数据表示为散点图。水平条表示平均值±S.E.M.统计分析：Kruskal-Wallis ANOVA；$p<0.05。微血管提取物中的肾素水平与整体认知和感知速度呈正相关（面板c和d）。观察到血管内neprilysin水平与Aβ40呈负相关趋势（图e），而与Aβ42无显著相关性（图f）。统计分析：皮尔逊相关系数。¶p<0.05，¶p<0.01。缩写：A/AD，阿尔茨海默病；ABC神经病理学诊断；C、 控制；临床Dx，临床诊断；cypB，亲环素B；M/MCI，轻度认知障碍；N/NCI，健康对照，无认知障碍；相对外径、相对光密度
图7
图7
淀粉样蛋白前体水平与微血管提取物中的Aβ肽浓度相关。Western blot检测微血管提取物中淀粉样蛋白前体（APP）的水平。数据用亲环素B标准化。a-c）参与者根据a）其AD神经病理学诊断进行分组；b） 他们的临床诊断和c）他们的载脂蛋白E4等位基因携带。在这些比较中没有观察到任何差异。按照随机顺序装载所有样本，并进行相同的免疫印迹实验。代表性照片示例采用了连续带。数据表示为散点图。横条表示平均值±S.E.M.统计分析：Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis方差分析；p>0.05。线性回归分析表明，APP水平与微血管提取物中的Aβ40（面板e）和Aβ42（面板f）浓度呈正相关。统计分析：皮尔逊相关系数。¶p<0.05，¶p<0.01。缩写：−，ApoE4非载体；+，载脂蛋白E4载体；A/AD、阿尔茨海默病；ABC Dx、ABC神经病理学诊断；淀粉样蛋白前体；C、 控制；临床Dx，临床诊断；cypB，亲环素B；M/MCI，轻度认知障碍；N/NCI，健康对照，无认知障碍；相对外径、相对光密度
图8
图8
AD患者和载脂蛋白E4携带者的β-分泌酶水平升高，并与认知和微血管提取物中的Aβ40肽相关。Western blot检测微血管提取物中β-分泌酶（BACE1）的水平。数据用亲环素B标准化。a-c）参与者根据a）其AD神经病理学诊断进行分组；b） 他们的临床诊断和c）他们的apoE4等位基因携带。我们观察到，在神经病理学诊断为AD（图a）或临床诊断为AD（图b）的个体中，BACE1水平增加。我们还观察到载脂蛋白E4的携带者与非携带者相比有所增加（面板c）。按照随机顺序装载所有样本，并进行相同的免疫印迹实验。为代表性的照片示例拍摄了连续的条纹。数据表示为散点图。横条表示平均值±S.E.M.统计分析：Mann-Whitney检验，*p<0.05；Kruskal-Wallis单因素方差分析，然后进行Dunn事后检验，$p<0.05。线性回归分析表明，BACE1水平与整体认知（面板d）和情景记忆（面板e）呈负相关。此外，BACE1水平与微血管提取物中的Aβ40浓度呈正相关（面板f）。此外，观察到aβ42呈正相关趋势（图g）。统计分析：皮尔逊相关系数。¶p<0.05，¶¶p<0.001。缩写：−，ApoE4非载体；+，载脂蛋白E4载体；A/AD、阿尔茨海默病；ABC Dx、ABC神经病理学诊断；C、 控制；临床Dx，临床诊断；cypB，亲环素B；M/MCI，轻度认知障碍；N/NCI，健康对照，无认知障碍；相对外径、相对光密度。
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参考文献

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