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.2018年12月9:24:789-800。
2018年eCollection。

任天堂尼抑制TGF-β诱导的人Tenon成纤维细胞转分化

仙柴林 1, 贾敏文 1, 刘荣娇 1, 武友高 1, 博区 1, 俞敏斌 1
附属公司

任天堂尼抑制TGF-β诱导的人Tenon成纤维细胞转分化

林贤猜等。 摩尔-维斯. .

摘要

目的：本研究旨在研究尼替达尼对人Tenon’s成纤维细胞（HTFs）转化为肌成纤维细胞的影响，并揭示其分子机制。

方法：将原代培养的HTFs与转化生长因子β1（TGF-β1）单独或与茚替达尼联合孵育，并分别通过细胞计数试剂盒-8（CCK8）和划痕试验测量细胞增殖和迁移。采用三维胶原收缩试验评估HTF收缩性。采用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、western blot、western-blot、RT-PCR检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和蜗牛的mRNA和蛋白水平，以及Smad2/3、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和细胞外信号调节激酶½（ERK1/2）的磷酸化水平，免疫荧光染色。

结果：任天堂以剂量依赖的方式抑制HTF的增殖和迁移。此外，nintedanib通过下调α-SMA和蜗牛的mRNA和蛋白表达来阻止HTF肌成纤维细胞分化。三维（3D）胶原凝胶收缩试验表明，尼替达尼能有效抑制TGF-β1诱导的肌成纤维细胞收缩。从机制上讲，我们揭示了nintedanib降低了TGF-β1诱导的Smad2/3、p38MAPK和ERK1/2的磷酸化，表明nintedani通过TGF-？的经典和非经典信号通路来阻止HTF激活。

结论：我们的研究提供了新的证据，证明尼替达尼对HTF具有强大的抗纤维化作用，并表明它可能被用作结膜下纤维化的潜在治疗剂。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
人Tenon成纤维细胞（HTFs）的特征。A类：用成纤维细胞标记物免疫染色鉴定HTFs，波形蛋白（绿色），细胞核（蓝色）用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记。比例尺=100μm。B类：HTF用上皮细胞标记物、细胞角蛋白进行免疫染色，细胞核（蓝色）用DAPI标记。比例尺=100μm。C类：用上皮细胞标记物、细胞角蛋白对晶状体上皮细胞进行免疫染色，用DAPI标记细胞核（蓝色）。比例尺=100μm。
图2
图2
任天堂抑制转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人Tenon成纤维细胞（HTF）增殖和运动。A类：用TGF-β1（5 ng/ml）在存在或不存在不同浓度硝苯地平（0.1μM，0.5μM，1μM）的情况下处理HTF 24 h。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定细胞增殖。B类：用TGF-β1（5 ng/ml）在存在或不存在不同浓度硝苯地平（0.1μM，0.5μM，1μM）的情况下处理HTF 24 h。通过5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入试验测定细胞增殖。C类：用TGF-β1（5 ng/ml）刺激HTF 24小时，在有或无硝苯地平（1μM）的情况下。通过伤口愈合试验评估细胞迁移。数据以平均值±标准偏差（SD；n个=3）独立重复实验(*第页<0.01; **第页<0.01; ***第页<0.001; ****第页与对照组或TGF-β1组相比<0.0001）。
图3
图3
任天堂尼抑制转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的三维（3D）胶原凝胶收缩和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。A类：用TGF-β1（5 ng/ml）处理人Tenon’s成纤维细胞（HTFs），在存在或不存在nintedanib（1μM）的情况下处理24 h。通过三维（3D）胶原晶格收缩实验检测凝胶收缩。B类,C类：在SB203580或nintedanib（1μM）存在或不存在的情况下，用TGF-β1（5 ng/ml）处理HTF 24 h(B类)和蛋白质(C类)分别用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和western blot分析α-SMA的表达，并将其归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达。数据以平均值±标准偏差（SD；n个=3）独立重复实验(*第页<0.01; ***第页<0.001; ****第页与对照组或TGF-β1组相比<0.0001）。
图4
图4
任天堂尼抑制转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和蜗牛的表达。A类：用TGF-β1（5 ng/ml）在SB203580或nintedanib（1μM）存在或不存在的情况下处理细胞24 h，然后用连接到异硫氰酸荧光素（FITC）和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；细胞核）的抗α-SMA染色。共聚焦显微镜检测免疫荧光。比例尺=200μm。B类,C类：用TGF-β1（5 ng/ml）在SB203580或nintedanib（1μM）存在或不存在的情况下处理人Tenon’s成纤维细胞（HTFs）24小时(B类)和蛋白质(C类)分别用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和western blot分析蜗牛的表达，并将其归一化为GAPDH表达。数据以平均值±标准偏差（SD；n个=3）独立重复实验(*第页<0.01;**第页<0.01;***第页<0.001; ****第页与对照组或TGF-β1组相比<0.0001）。
图5
图5
任天堂尼在以后的时间点抑制转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的Smad2/3、p38MAPK和ERK1/2激活。用TGF-β1（5 ng/ml）在SB203580或nintedanib（1μM）存在或不存在的情况下处理人Tenon’s成纤维细胞（HTFs）24 h(A类)、p-p38MAPK和p-ERK1/2(B类)分别用定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和western blot分析mRNA和蛋白表达，并将其归一化为总Smad2/3、ERK1/2或GAPDH。数据表示为平均值±标准偏差（SD；n个=3）个独立重复实验(*第页<0.01;****第页与对照组或TGF-β1组相比<0.0001）。
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