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.2018年10月12日；9(1):4245.
doi:10.1038/s41467-018-06674-4。

利用化学诱导的蛋白质聚集体探测聚集性

安妮·F·J·詹森 1, 尤金·卡特鲁卡 1, 温迪·范·斯特拉顿 1, 波琳·维尔哈克 2, 富尔维奥·雷吉奥里 2, Lukas C Kapitein公司 三
附属公司

利用化学诱导蛋白聚集体探讨聚集性

安妮·F·J·詹森等。 国家公社. .

摘要

选择性的自噬调节特定细胞成分的清除，对维持细胞内环境稳定至关重要。然而，直接诱导和监测此类途径的工具有限。在这里，我们介绍了PIM（由多重聚合诱导的粒子）分析作为研究聚集性的工具，即聚集物的自噬清除。该检测使用可诱导的多重聚合模块来组装蛋白质簇，在诱导后，这些蛋白质簇在被输送到溶酶体之前招募泛素、p62和LC3。此外，使用双荧光标记可以直接观察到向溶酶体的簇递送。利用流式细胞术和荧光显微镜，我们发现溶酶体的转运部分依赖于p62和ATG7。该测定将有助于阐明自噬-溶酶体系统清除聚集物的时空动力学和控制机制。

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图1
图1
细胞中簇的形成和降解。一检测：rapalog2诱导的同二聚体诱导红/绿PIM（由多重聚合诱导的颗粒），仅在进入溶酶体时变红。b条表达PIM结构的HeLa细胞显示簇的形成和降解。反转对比度灰度图像显示mCherry通道，而插入显示合并图像。左侧和中间面板的图像对比度是右侧面板的2倍。完整单元的合并图像如图S2所示。c（c）单个簇的时间推移图像。箭头跟踪显示颜色转换的簇。d日单个簇的归一化mCherry（红色）和EGFP（绿色）荧光强度与时间的关系（平均值 ± s.e.m.公司。n个 = 9个集群）。t吨 = 0表示进入溶酶体。e（电子）HeLa细胞簇的免疫荧光图像24 簇形成后h。面板显示LAMTOR4（青色面板）、mCherry中的簇（红色面板）和EGFP通道（绿色面板）的内源性染色。（f）16的量化 单个细胞的活细胞成像。每个细胞总簇（黑色）、红色和绿色簇（黄色）以及红色簇（红色）的平均数量（平均值 ± s.e.m.公司。n个 = 来自3个独立实验的11个细胞）。这个x轴表示添加rapalog2后的时间。克红色聚类在总聚类中的平均分数。数据均为平均值 ± s.e.m.公司。n个 = 来自3个独立实验的11个细胞。比例尺，10 微米(b条)和2 微米(c（c）,e（电子）)
图2
图2
利用自噬机制对PIM簇进行克隆化。代表性HeLa细胞的免疫荧光图像8 用rapalog2加成簇诱导后h。泛素的mCherry（红色）、EGFP（绿色）和内源性染色（青色）(一)，第62页(b条)，NBR1(c（c）)，LC3(d日,e（电子）)、和灯4(（f）)以反差显示。对于e（电子），用200 nM Bafilomcyin A1用于8 h.比例尺，10 微米。缩放显示单个簇，比例尺2 微米。图中显示了与每个细胞标记共定位的黄色（黄色圆圈）和红色（红色方块）簇的分数。平均值 ± s.e.m.来自两个独立的实验n个 = 用于一–（f）分别是。未经rapalog2处理的PIM表达细胞的图像，请参见补充图4
图3
图3
不同时间点的群集降级。聚类形成后不同时间点聚类的归一化EGFP/mCherry比率的分布一0.2%二甲基亚砜处理的HeLa WT细胞，b条用200 nM巴非霉素A1，以及c（c）HeLa p62KO#1细胞。每个直方图表示>3000个簇。平均值 ± 来自3个独立实验的s.e.m，每个条件下40–60个细胞。红色簇的百分比表示为3个独立实验中EGFP/mCherry比率<0.3的簇的平均分数。d日中分析的簇的大小分布一–c（c）和图S5。显示了属于不同大小类别的EGFP-和mCherry阳性簇（黄色，EGFP/mCherry比率>0.3）和mCherly阳性簇的分数（红色，EGFP/mCherry<0.3）。数据表示为平均值 ± 标准差(n个 = 3). **P（P） ≤ 0.01***P（P） ≤ 0.001 ****P（P） ≤ 0.0001（采用Sidak事后检验的单向方差分析）。e（电子）黄色团簇的尺寸分布分析一–c（c）和图S5a。数据表示为平均值 ± 标准差(n个 = 3). *P（P） ≤ 0.05（采用Dunnett事后检验的单向方差分析）。比例尺10 微米
图4
图4
使用流式细胞仪进行全人群PIM降解。用rapalog2处理细胞并用FACS分析GFP/mCherry比率的变化。图中显示了GFP/mCherry比率的散点图和匹配直方图。一添加rapalog2后不同时间点HeLa WT细胞的代表性数据。b条8和16岁时HeLa WT细胞的代表性数据 用Bafilomycin A1处理添加rapalog2后h。c（c）p62KO#1在8和16的代表性数据 添加rapalog2后h。d日添加rapalog2后不同时间点ROI1中HeLa WT细胞的百分比。来自三个独立实验的数据。e（电子）HeLa WT、Bafilomycin A1处理细胞、p62KO#1和p62KO#2在8和16时ROI1中的细胞百分比 添加rapalog2后h。平均值 ± 来自三个独立实验的s.d。单向方差分析揭示F类 = 8.516，P（P） = 8人0.0072 h和F类 = 9.422,P（P） = 16人0.0053 h.Dunnett的事后测试：*P（P） ≤ 0.05, **P（P） ≤ 0.01
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