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.2018年7月2日；13（7）：e0199916。
doi:10.1371/journal.pone.0199916。 2018年eCollection。

营养不良的长期代谢影响：早期蛋白质限制后的肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗

普拉萨德·S·达尔维 1 2, 由史蒂文·杨 1, 内森·斯温 1, 金俊秀（Junsoo Kim） 1, Senjuti Saha公司 1, 塞琳·波登 1, 张玲（Ling Zhang） 1, 玫瑰查米 三 4, Robert H J Bandsma公司 1 5
附属公司

营养不良的长期代谢影响：早期蛋白质限制后的肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗

普拉萨德·S·达尔维等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

出生后早期营养不良在全球仍然普遍存在，大约45%的儿童死亡与营养不良有关。目前尚不清楚儿童营养不良的幸存者是否会受到长期的代谢影响，尤其是当他们晚年接触富含脂肪和碳水化合物的肥胖饮食时。由于对这种饮食“双重负担”缺乏了解，需要进行研究，以了解以前营养不良儿童的长期后果。我们假设，对小鼠早期低蛋白摄入的营养损害会导致长期代谢紊乱，从而加剧饮食诱导的胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝（NAFLD）的发展。我们研究了断奶四周后立即喂食低蛋白饮食（4%wt/wt）和随后喂食高碳水化合物高脂肪饮食16周对NAFLD代谢功能和发育的影响。暴露于早期蛋白质限制的小鼠在通过常规饮食喂养恢复后表现出短暂的葡萄糖不耐受。然而，小鼠断奶后的蛋白质限制并没有加剧肥胖饮食诱导的胰岛素抵抗或进展为NAFLD。这些数据表明，早期短暂的蛋白质限制不会加剧肥胖饮食诱导的NAFLD和胰岛素抵抗。

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数字

图1
图1。评估喂食低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）或等热量正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）的C57BL/6小鼠的体重增加、生长、发育迟缓、胰腺重量和肝脏重量，然后喂食4周的恢复期食物，最后接触16周的食物或HFHC食物。
（A） 实验方案：断奶后给小鼠喂食每种食物。断奶后的前四周被指定为第一次负荷/营养不良的时期，接下来的4周喂食食物是恢复期，最后16周是第二次负荷的时期。为了进行间接热量分析，小鼠被放置在代谢笼中3次，每次大约在新饮食方案开始前或牺牲前一周。（B） 在24周的整个实验期间，每周对体重变化进行评估。从第1周到第13周，喂食NPD的小鼠的体重显著高于喂食LPD的小鼠（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠；双向方差分析；相互作用*P（P）<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试）。喂食NPD/HFHC的小鼠的体重明显高于喂食NPD的小鼠（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠，#<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试）。同样，喂食LPD/HFHC的小鼠体重明显高于喂食LPD/chow的小鼠（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠，§<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试）。（C） 在每个喂养期结束时，计算从断奶时获得的总体重。喂食NPD的小鼠在喂食前4周结束时比喂食LPD的小鼠体重增加更多（所有数据均以平均值±SD表示*P（P）<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试）。喂食NPD或LPD的小鼠在4周恢复期结束时体重增加没有统计学差异。喂食NPD或LPD的小鼠在经过16周的恢复和HFHC喂食后，体重明显增加，而喂食NPD-或LPD小鼠在经过恢复和饮食喂食后体重明显增加（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠，#和§<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试）。（D） 在每个喂食期结束时测量带尾巴的整个身体的最终长度。喂食前4周结束时，喂食LPD的小鼠的这些长度小于喂食NPD的小鼠（每组n≥4只**P（P）<0.01，学生的t吨-测试）。（E） 在每个喂养期间测量每周平均食物摄入量。在第一个负荷/营养不良期间，喂食过LPD和NPD的小鼠的每周食物摄入量没有显著差异。在恢复期，与喂食NPD的小鼠相比，喂食LPD的小鼠每周的食物摄入量显著增加。在喂食HFHC饮食期间，喂食NPD和LPD的小鼠每周的食物摄入量均显著减少（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05时，#P（P）与LPD喂养的小鼠相比<0.05，Tukey’s事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。
图2
图2。C57BL/6小鼠在第一次负重/营养不良期间喂食正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）或低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）4周结束时的静息状态下全身代谢评估，恢复期喂食4周的周粮，以及在第二个负荷期进行16周的食物或HFHC饮食喂养。
（A-C）休息状态下24小时监测期间的能量消耗和（D-F）呼吸交换比由方法部分所述的间接量热法测定（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，图基氏事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。
图3
图3。在第一负荷/营养不良期喂食正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）或低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）4周结束时，对C57BL/6小鼠的胰腺重量、空腹血糖和胰岛素以及胰岛素抵抗进行评估，在恢复期喂食4周的周粮，以及在第二个负荷期进行16周的食物或HFHC饮食喂养。
（A） 称重小鼠胰腺体外在每个喂食期之后。只有喂食LPD的小鼠和喂食LPD/HFHC的小鼠的胰腺绝对重量低于匹配的对照小鼠（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05时，#P（P）在第一次负荷/营养不良期的4周结束时，与喂食LPD的小鼠相比，<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（B） 称重小鼠胰腺体外在每个喂食期之后。与匹配的对照小鼠相比，在第一次负荷/营养不良期的4周结束时和喂食HFHC的16周结束时，喂食LPD的小鼠的胰腺体重比更低。在恢复期，与第一次负重/营养不良期相比，喂食LPD的小鼠的胰腺体重比显著增加。在HFHC饮食喂养16周结束时，NPD喂养的小鼠胰腺与体重的比例较低（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05时，†††P（P）恢复后<0.001 vs.喂食NPD的小鼠，§P（P）恢复后与喂食LPD的小鼠相比<0.05，#P（P）营养不良4周结束时，与喂食LPD的小鼠相比，<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（C） 尸检时测量空腹血糖水平。仅在喂食高氟碳化合物16周结束时，LPD/HFHC-fed小鼠的空腹血糖水平显著升高（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（D） 尸检时测量空腹胰岛素水平。营养不良期结束时，只有LPD喂养的小鼠的空腹胰岛素水平低于NPD喂养的对照小鼠，而NPD/HFHC-和LPD/HFHC-fed小鼠的空肠胰岛素水平高于相应的饮食控制组（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（E） 利用空腹血糖和胰岛素水平的数据计算胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）。与喂食NPD的对照组相比，只有喂食LPD的小鼠的HOMA-IR较低，而喂食NPD/HFHC-和LPD/HFHC的小鼠的HOMA-IR高于喂食相应食物的对照组。恢复期后，NPD喂养的小鼠和LPD喂养的小鼠的HOMA-IR没有统计学差异（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。
图4
图4。C57BL/6小鼠在第一个负荷/营养不良期的正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）或低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）喂养4周、恢复期的4周和第二个负荷期的16周时的糖耐量评估。
（A、C、E）禁食6小时的小鼠在注射葡萄糖后2小时内进行所有腹腔内葡萄糖耐量试验（IPGTT）。（B、D、F）计算IPGTT在0至120分钟内的AUC。恢复后喂食LPD的小鼠以及LPD/HFHC小鼠与匹配的对照小鼠相比AUC（葡萄糖）增加。与匹配的对照小鼠相比，NPD/HFHC喂养的小鼠也具有更高的AUC增加。营养不良4周结束时，NPD喂养和LPD喂养小鼠的AUC无统计学差异（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）恢复后与喂食NPD的小鼠相比<0.05，#P（P）与NPD/HFHC-fed小鼠相比<0.05，§P（P）<0.05与LPD/HFHC-fed小鼠、Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。
图5
图5。C57BL/6小鼠在第一个负荷/营养不良期喂食正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）或低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）、恢复期喂食4周周周周日粮以及第二个负荷期喂食16周日粮或HFHC饮食结束时的肝脏病理学评估。
（A） 小鼠肝脏称重体外在每个喂食期之后。只有喂食NPD/HFHC的小鼠的肝脏重量大于喂食食物的NPD小鼠（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05，NS（不显著）P（P）值>0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（B） 在每个喂养期后对小鼠肝脏进行离体称重。各组之间的肝体重比没有差异（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（C） 肝脏甘油三酯水平在牺牲时测定。4周后喂食LPD的小鼠肝脏中的甘油三酯水平高于喂食NPD的小鼠，并且NPD/HFHC-fed和LPD/HFHC-fed小鼠的甘油二酯水平高于相应的饮食控制组。与营养不良期相比，喂食LPD的小鼠恢复后的肝脏甘油三酯水平显著降低（所有数据均以平均值±SD表示，每组n≥4只小鼠*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001,†††P（P）恢复后<0.001 vs.喂食NPD的小鼠，§§§P（P）恢复后<0.001 vs.喂食LPD的小鼠，#P（P）营养不良4周结束时，与喂食LPD的小鼠相比，<0.05，Tukey's事后（post-hoc）测试，单向方差分析）。（D） 组织学分析。肝脏石蜡切片苏木精-伊红染色显示，喂食NPD和LPD的小鼠在恢复和喂食16周后组织学正常；在恢复和HFHC饮食喂养16周后，在NPD喂养和LPD喂养的小鼠中观察到炎症浸润（黑色箭头）、微泡（箭头）和大泡（星号）脂肪变性；CV，中央静脉；PT，门静脉三联体（放大倍数：X10，Bar=200μm；X20，Bar=100μm，X40，Bar=50μm）。
图6
图6。在第一个负荷/营养不良期喂食正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）或低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）的4周、恢复期喂食4周和第二个负荷期喂食16周的chow或HFHC饮食的C57BL/6小鼠的肝脏基因表达评估。
通过实时RT-PCR测定促炎细胞因子（TNF-α、IL-1α、IL-1-β、MCP-1）、炎症组分（NLRP3）和炎症细胞标记物（CD68、F4/80）的肝脏mRNA水平，并以18S核糖体RNA的相对表达单位表达（所有数据均以平均值±SEM表示，每组n≥4只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，学生t吨-测试）。
图7
图7。在第一个负荷/营养不良期喂食正常蛋白饮食（NPD，对照饮食）或低蛋白饮食（LPD，营养不良饮食）的4周、恢复期喂食4周和第二个负荷期喂食16周的chow或HFHC饮食的C57BL/6小鼠的肝脏基因表达评估。
用实时RT-PCR测定肝纤维化前标志物（胶原蛋白α1（I）、胶原蛋白αl（IV）、PAI-1、TGFβ1、TIMP1、α-SMA）和氧化应激标志物（CYP2E1、Nqo1）的mRNA水平，并以18S核糖体RNA的相对表达单位表示（所有数据均以平均值±SEM表示，每组n≥4只小鼠*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，学生t吨-测试）。
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