Trans-Fats Inhibit Autophagy Induced by Saturated Fatty Acids

doi:10.1016/j.ebiom.2018.03.028

。2018年4月：30:261-272。

doi:10.1016/j.ebiom.2018.03.028。 Epub 2018年3月27日。

反式脂肪酸抑制饱和脂肪酸诱导的自噬

附属机构

¹巴黎笛卡尔大学，巴黎城市索邦大学，法国巴黎；法国巴黎Cordeliers中心，法国国家癌症防治中心，11个标签；法国巴黎U1138国立圣母院医学研究所；法国巴黎皮埃尔与玛丽·居里大学；代谢组学和细胞生物学平台，法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西癌症校区。
²美国新泽西州纽瓦克市新泽西医学高中罗格斯分校。
^三分子生物科学研究所，NAWI格拉茨，格拉茨大学，格拉茨，奥地利。
⁴奥地利格拉茨格拉茨大学NAWI格拉茨分子生物科学研究所；英国肯特郡坎特伯雷肯特大学生物科学学院肯特真菌集团。
⁵美国新泽西州纽瓦克市新泽西医学高中罗格斯分校；奥地利格拉茨BioTechMed-Graz。
⁶巴黎笛卡尔大学，巴黎城市索邦大学，法国巴黎；法国巴黎Cordeliers中心，法国国家癌症防治中心，11个标签；法国巴黎U1138国立圣母院医学研究所；法国巴黎皮埃尔和玛丽·居里大学；代谢组学和细胞生物学平台，Gustave Roussy癌症校区，法国维勒朱夫。电子地址：captain.olsen@gmail.com。
⁷巴黎笛卡尔大学，巴黎城市索邦大学，法国巴黎；法国巴黎Cordeliers中心，法国国家癌症防治中心，11个标签；法国巴黎U1138国立圣母院医学研究所；法国巴黎皮埃尔和玛丽·居里大学；法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西癌症校区代谢组学和细胞生物学平台；法国克里姆林宫比基特巴黎南大学医学院；法国巴黎AP-HP，Georges Pompidou欧洲医院，生物制品中心；瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院妇幼健康部。电子地址：kroemer@orange.fr。

PMID： 29606629
预防性维修识别码：项目经理5952403
内政部： 2016年10月10日/j.ebiom.2018.03.028

反式脂肪酸抑制饱和脂肪酸诱导的自噬

艾伦·索瓦特等。 EBioMedicine公司。 2018年4月。

。2018年4月：30:261-272。

doi:10.1016/j.ebiom.2018.03.028。 Epub 2018年3月27日。

附属机构

¹巴黎笛卡尔大学，巴黎城市索邦大学，法国巴黎；法国巴黎Cordeliers中心，法国国家癌症防治中心，11个标签；法国巴黎U1138国立圣母院医学研究所；法国巴黎皮埃尔和玛丽·居里大学；代谢组学和细胞生物学平台，法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西癌症校区。
²美国新泽西州纽瓦克市新泽西医学高中罗格斯分校。
^三奥地利格拉茨格拉茨大学NAWI格拉茨分子生物科学研究所。
⁴奥地利格拉茨格拉茨大学NAWI格拉茨分子生物科学研究所；肯特大学生物科学学院肯特真菌小组，英国肯特郡坎特伯雷。
⁵美国新泽西州纽瓦克市新泽西医学高中罗格斯分校；奥地利格拉茨BioTechMed-Graz。
⁶巴黎笛卡尔大学，巴黎索邦大学，法国巴黎；法国巴黎Cordeliers中心，法国国家癌症防治中心，11个标签；法国巴黎U1138国立圣母院医学研究所；法国巴黎皮埃尔和玛丽·居里大学；代谢组学和细胞生物学平台，法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西癌症校区。电子地址：captain.olsen@gmail.com。
⁷巴黎笛卡尔大学，巴黎城市索邦大学，法国巴黎；法国巴黎Cordeliers中心，法国国家癌症防治中心，11个标签；法国巴黎U1138国立圣母院医学研究所；法国巴黎皮埃尔与玛丽·居里大学；法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西癌症校区代谢组学和细胞生物学平台；法国克里姆林宫比基特巴黎南大学医学院；法国巴黎AP-HP，Georges Pompidou欧洲医院，生物制品中心；瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院妇幼健康部。电子地址：kroemer@orange.fr。

PMID： 29606629
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内政部： 2016年10月10日/j.ebiom.2018.03.028

摘要

天然脂肪酸具有明显的生物效应，这取决于其碳骨架的长度和饱和状态。因此，额外供应最丰富的天然顺-不饱和脂肪酸（油酸），而不是最丰富的饱和脂肪酸，棕榈酸，可以延长模式生物的寿命。在这里，我们系统地比较了不同饱和、顺-非饱和和外来（工业或反刍动物）反-非饱和脂肪酸在体外激发细胞应激的能力，在培养的人类细胞上表达一系列不同的生物传感器，检测自噬、高尔基体应激和未折叠蛋白反应的迹象。与顺-不饱和脂肪酸相比，反-不饱和脂酸不能刺激自噬迹象，包括GFP-LC3B阳性斑点的形成、磷脂酰肌醇-3-磷酸的产生和转录因子TFEB的激活。在评估联合作用时，几种反式不饱和脂肪酸，包括油酸反式异构体（elaidic acid）、亚油酸、反式维生素A和棕榈酸，在抑制棕榈酸诱导的自噬和内质网应激方面非常有效，但油酸没有。在小鼠体内、肝脏和心脏中，依拉酸还抑制棕榈酸诱导的自噬。我们的结论是，反式不饱和脂肪酸的公认毒性，尽管在机械上是神秘的，但可能存在于其消除饱和脂肪酸诱导的细胞保护应激反应的能力中。

关键词：老化；细胞保护；禁食的；免疫反应；免疫监测；生酮饮食；肥胖；系统生物学。

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图1
选定FA的细胞摄取和自噬诱导。（A，B）用指示的FA（黑色饱和FA，反式-蓝色的不饱和FA，顺式-红色的不饱和脂肪酸，以及两者都有的不饱和FA反式-以及顺式-绿色债券）或未经处理（A，B中的对照）6 h.细胞裂解后用GC/MS测定细胞内FA含量，并计算每个FA的分数。未经处理条件下的基础FA水平分数以饼图形式在a中报告，相对浓度总计达100%。添加每个FA后相对浓度的变化以B中的条形图显示，列中的黑色部分表示增加。用FAs处理稳定表达GFP-LC3的（C，D）U2OS细胞，如A所示⁺dots被评估为自噬指标。数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(*Ş=Ş对 < 0.05; **=对 < 0.01;***=对 < 0.001). 代表性图像显示在C中。比例尺等于10 微米。（E） U2OS细胞用500 μM OL、EL或PA如所示，或在有或无氯喹的情况下未经治疗（对照）6 h.然后，处理细胞，通过SDS-PAGE和免疫印迹测定LC3的脂质化和p62的降解。G3PD作为负荷控制进行测量。（F） U2OS WT和ATG5敲除细胞（ATG5KO）用500 μM OL、EL或PA用于或未经治疗（对照）6 然后收集h和，通过SDS-PAGE和免疫印迹进行蛋白质分离。通过特异性抗体评估LC3脂质化和p62降解，并测量GAPDH作为负荷对照。

图2
FAs诱导的自噬相关信号通路。（A-F）FYVE-RFP稳定表达的U2OS细胞（A，B）、GFP-TFEB稳定表达U2OS的细胞（C，D）和野生型U2OS（E，F）用500 μM FA，如6所示 h（A-F）和16 h（E，F）。采集固定细胞的图像和FYVE-RFP的面积⁺点被测量作为自噬诱导的指标（B）。测量细胞核和细胞质GFP-TFEB荧光强度，以及核和细胞质值之间的比值（GFP_{细胞核/细胞}计算比率）以指示TFEB核易位（D）。细胞核用Hoechst 33342和携带正常细胞核的细胞数量进行染色(即测定“健康细胞”）（F）。数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(*=对Ş<0.05;**=对 < 0.01;*** = 对 < 0.001). FYVE-RFP、GFP-TFEB和生存能力的代表性图像分别显示在A、C、E中。比例尺等于10 A、C和50中的μm μm。

图3
FAs对内质网应激反应的影响。pSMALB-ATF4.5rep（A，B）和XBP1-ΔDBD-静脉（C，D）稳定表达的U2OS细胞用500 所示μM FA或3 μM thapsgargin或突尼斯霉素作为阳性对照16例 h.固定后，测量ATF4-GFP和XBP1-静脉细胞质强度，然后计算细胞质GFP强度高于阈值的细胞百分比（B，D）。数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(*=对 < 0.05; **=对 < 0.01; ***=对 < 0.001). ATF4-GFP或XBP1-venus的代表性图像分别显示在（A，C）中，比例尺等于10 微米。（E，F）U2OS（E）和HepG2（F）细胞用250 μM或500 所示μM FA或3 μM thapsigargin作为16例患者的阳性对照 h.然后，通过SDS-PAGE分离蛋白质，并进行免疫印迹检测剪接XBP1（XBP1s）、磷酸化p38（也称为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK））和脂化LC3。

图4
FAs对高尔基体和脱乙酰酶表达的影响。（A，B）稳定表达野生型和GALT1-GFP的U2OS细胞用500 所示μM FA或10 μM高尔基体A作为阳性对照16 h.根据荧光信号的面积、细胞质强度和细胞质内的分布，固定细胞的高尔基体聚集成“碎片”或“降解”；此后计算具有一种或另一种表型的细胞的百分比（B）。对照组、棕榈酸酯、油酸盐和乳酸的代表性图像显示在A中。比例尺等于10 微米。（C，D）U2OS细胞用500 μM FA或未经处理6 h.固定后，用特异性抗体处理细胞以阻断乙酰化微管蛋白，然后用乙酰化赖氨酸蛋白特异性抗体进行免疫荧光。测定乙酰化赖氨酸细胞质荧光强度。数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(*=对 < 0.05; **=对 < 0.01）（D）。对照组、棕榈酸酯、油酸盐和乳酸的代表性图像显示在C中。比例尺等于10 微米。

图5
FAs生物效应的系统分析。（A） FA在之后分层聚集Z轴-计算每个测量参数的得分，然后用热图报告（GOH，高尔基形态正常的细胞百分比；VIAB，健康细胞计数；ACE乙酰化蛋白强度；GOS，显示高尔基体碎片的细胞百分比，GFP-TFEB_{细胞核/细胞}强度比；XBP1/ATF4，高静脉/GFP强度的细胞百分比；GOV，高尔基体降解的细胞百分比；INT，细胞摄入量的分数增加）。（B）根据Z评分建立相关矩阵；对角线表示每个参数的Z分数分布；上部面板显示皮尔逊相关系数(*=对 < 0.05;**=对 < 0.01;***=对 < 0.001); 下部面板描绘了双参数图和线性回归（红线）。（C）一组化学描述符（MW，分子量；RBC，可旋转结合计数；BSC，键立体中心计数；NCU，顺-不饱和数；其他缩写在网页中报告http://sysbiolab.bio.ed.ac.uk/wiki/index.php/CDK_Small_Mollecule_Descriptors)对每个FA进行计算，然后将其与测量的生物参数（doi：10.17632/3d2zvjbh7z.1号); 皮尔逊相关系数在相关矩阵上以点的形式表示，大小代表绝对值，并将实际值（范围从−1，红色到+1）涂成蓝色。（D）绘制主成分分析的两个主要维度的坐标，轴报告惯性百分比。多边形表示在K-Means分析后对FA进行分类的组。每个点上方的数字代表碳链长度以及每个相应FA的NCU。

图6
油酸对饱和脂肪酸自噬诱导的抑制作用。稳定表达GFP-LC3的（A，B）U2OS细胞用500 μM FA或10 μM来自ENZO SCREEN-WELL自噬文库的自噬诱导物亚群，在存在或不存在500 6μM EL h.固定后通过测量每个细胞内LC3点的面积来评估自噬。计算了使用和不使用EL联合治疗的相对差异，并在A中以条形图的形式报告。代表性图像显示在B中。比例尺等于10 微米。（C） U2OS细胞用任一载体（0.5%乙醇）处理，500 μM OL、PA或硬脂酸盐，存在或不存在500 μM依莱达6 h.此后，通过免疫印迹法测定LC3脂质氧化和p62降解以及p38活化，作为自噬指标。（D）采集U2OS细胞，在C中用OL、PA和硬脂酸盐处理，并用GC/MS进行分析，以测量细胞内FA浓度，并测试EL对细胞摄取FA的影响。数据为至少三个独立实验的平均值±SEM（*=p < 0.05, **=对 < 0.01, ***=对 < 0.001，用单一FA处理的细胞中FA浓度与用载体控制处理的细胞相比#=对 < 0.05，接受EL联合处理的细胞中FA浓度与单FA处理的细胞）。将（E，F）FYVE-RFP（E）和GFP-TFEB（F）稳定表达的U2OS细胞作为C细胞处理⁺分析dots和TFEB核转位。数据是至少三个独立实验的平均值±SEM(* = 对 <0.05, **=对 < 0.01, ***=对 < 0.001，FYVE点表面或GFP-TFEB_{细胞核/细胞}具有EL的细胞与未与EL共同处理的细胞的比率）。

图7
不同脂肪酸诱导自噬的依来酸效应的剂量反应和动力学分析。稳定表达GFP-LC3的（A，B，C）U2OS细胞用浓度增加的EL（A，B，C）、亚麻酸、反式维甲酸或棕榈酸（C）处理，并与指示浓度增加的PA（A，C）或OL（B）共同处理或不处理2，4，6，16（A，A，B）或24 h（A、B、C）。固定后，通过免疫荧光观察磷酸化eIF2α。对于每个治疗，通过量化LC3点的面积来测量自噬的程度。通过免疫荧光法测量磷酸化eIF2α来监测ER-Stress，并通过列举描述健康形态的细胞数量来量化活性损失。数据用热图表示，最大效应用红色表示，最小效应用蓝色表示。（D）仅向C57BL/6小鼠腹腔注射溶媒，100 毫克/千克PA，100 mg/kg EL或两种FA的组合。2 h后处死小鼠，采集心脏和肝脏进行免疫印迹。检测到LC3脂质化和p62降解，以表明自噬活性。监测GAPDH水平，以确保负荷相等。（E）携带GFP-LC3报告基因的转基因小鼠用PA、EL或其组合进行治疗。冰冻切片取自心脏，然后在荧光显微镜上成像。在获得的图像上确定每个细胞的GFP-LC3点的平均数。条形图上显示的结果代表了三只小鼠的平均值*对 < 0.05. GFP-LC3点的代表性显微照片与条形图一起显示；为提高能见度，增强了圆点的局部对比度。比例尺代表10 微米。（F） MEFs野生型（WT）或eIF2α（KI）中携带非磷酰基敲入突变，两者均稳定表达GFP-LC3，在有或无500 μM EL用于2、4和6 h.固定后对细胞进行成像，并通过测量每个细胞的LC3点总面积来测量自噬水平。量化描述为热图，最大效果用红色表示，最小效果用蓝色表示。

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