Dysregulated phosphorylation of Rab GTPases by LRRK2 induces neurodegeneration

doi:10.1186/s13024-018-0240-1

。2018年2月13日；13(1):8.

doi:10.1186/s13024-018-0240-1。

LRRK2对Rab GTPases磷酸化的失调诱导神经退行性变

附属机构

¹韩国首尔庆熙大学研究生院神经科学系。
²韩国科学技术研究院（KIST）脑科学研究所神经科学中心，5 Hwarang-ro 14-gil，Seongbuk-gu，Seoul，02792，韩国。
^三韩国首尔KIST痴呆症诊断、治疗和护理系统汇聚研究中心。
⁴韩国首尔韩国科技大学KIST学院生物医学科学与技术部。
⁵韩国水原阿周大学医学院生理学系。
⁶韩国仁川HuGex有限公司。
⁷韩国水原SugKyunKwan大学医学院单细胞网络研究中心三星生物医学研究所分子细胞生物学系药理学部。
⁸韩国首尔KIST功能连接组学中心。
⁹美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所和神经病学系神经变性和干细胞项目。
¹⁰美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生理学系。
¹¹美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院所罗门·H·斯奈德神经科学系。
¹²美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院药理学与分子科学系。
¹³韩国科学技术研究院（KIST）脑科学研究所神经科学中心，5 Hwarang-ro 14-gil，Seongbuk-gu，Seoul，02792，韩国。ehur@kist.re.kr。
¹⁴韩国首尔KIST痴呆症诊断、治疗和护理系统汇聚研究中心。ehur@kist.re.kr。
¹⁵韩国首尔韩国科技大学KIST学院生物医学科学与技术部。ehur@kist.re.kr。
¹⁶韩国首尔庆熙大学研究生院神经科学系。bdaelee@khu.ac.kr。
¹⁷韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学医学院生理学系，26 Kyungheedae-ro。bdaelee@khu.ac.kr。

PMID： 29439717
预防性维修识别码： PMC5811984年
内政部： 10.1186/s13024-018-0240-1

LRRK2对Rab GTPases磷酸化的失调诱导神经退行性变

Ga Ram Jeong先生等。摩尔神经变性剂。 2018。

。2018年2月13日；13(1):8.

doi:10.1186/s13024-018-0240-1。

附属机构

¹韩国首尔庆熙大学研究生院神经科学系。
²韩国科学技术研究院（KIST）脑科学研究所神经科学中心，5 Hwarang-ro 14-gil，Seongbuk-gu，Seoul，02792，韩国。
^三韩国首尔KIST痴呆症诊断、治疗和护理系统汇聚研究中心。
⁴韩国首尔韩国科技大学KIST学院生物医学科学与技术部。
⁵韩国水原Ajou大学医学院生理学系。
⁶HuGex有限公司，韩国仁川。
⁷韩国水原SugKyunKwan大学医学院单细胞网络研究中心三星生物医学研究所分子细胞生物学系药理学部。
⁸韩国首尔KIST功能连接组学中心。
⁹美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所和神经病学系神经变性和干细胞项目。
¹⁰美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生理学系。
¹¹美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院所罗门·H·斯奈德神经科学系。
¹²美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院药理学与分子科学系。
¹³韩国科学技术研究院（KIST）脑科学研究所神经科学中心，5 Hwarang-ro 14-gil，Seongbuk-gu，Seoul，02792，韩国。ehur@kist.re.kr。
¹⁴韩国首尔KIST痴呆症诊断、治疗和护理系统汇聚研究中心。ehur@kist.re.kr。
¹⁵韩国首尔韩国科技大学KIST学院生物医学科学与技术部。ehur@kist.re.kr。
¹⁶韩国首尔庆熙大学研究生院神经科学系。bdaelee@khu.ac.kr。
¹⁷韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学医学院生理学系，26 Kyungheedae-ro。bdaelee@khu.ac.kr。

PMID： 29439717
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内政部： 10.1186/s13024-018-0240-1

摘要

背景：富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）的突变是家族性和散发性帕金森病（PD）最常见的病因。激酶活性升高与LRRK2毒性有关，但介导神经退行性变的底物尚不明确。鉴于越来越多的证据表明LRRK2在膜和囊泡运输中发挥作用，我们系统筛选了囊泡动力学的核心调节因子Rab GTPases作为LRRK_2的潜在底物，并研究了这种磷酸化在细胞和体内的功能后果。

方法：用45个纯化的人Rab GTPase进行体外LRRK2激酶检测，以确定Rab家族蛋白作为LRRK2.底物。我们通过串联质谱法确定了磷酸化位点，并通过评估体外LRRK2激酶试验和细胞内的磷酸化来确认。通过颅内注射表达Rab35野生型或磷酸化突变体的腺相关病毒载体（AAV），在原代培养和体内检测Rab磷酸化对神经变性的影响。

结果：我们的筛选显示，LRRK2在开关II区域保守的苏氨酸残基磷酸化了几个Rab GTPase，并且通过使用激酶活性LRRK2-D1994A、致病性LRRK2-G2019S以及LRRK_2位点突变的Rab蛋白，我们验证了Rab蛋白的一个子集，包括Rab35、，是LRRK2在体外和细胞内的真实底物。我们还发现，Rab的磷酸化调节细胞中的GDP/GTP结合特性。此外，在初级皮层神经元中，一些Rab中LRRK2位点的突变导致了神经毒性，而Rab35的磷酸化突变体诱导的神经毒性最为严重。此外，将AAV-Rab35-T72A或AAV-Rab35-T72D颅内注射到黑质实质上诱导了体内多巴胺能神经元的变性。

结论：在这里，我们表明Rab GTPases的一个子集是LRRK2在体外和细胞内的真实底物。我们还提供证据表明，LRRK2位点Rab磷酸化的失调会导致体内初级神经元的神经毒性和多巴胺能神经元的变性。我们的研究表明，Rab GTPases可能在PD进展中介导LRRK2毒性。

关键词：LRRK2；神经变性；帕金森病；磷酸化；兔GTPases。

PubMed免责声明

利益冲突声明

道德审批

根据韩国科学技术研究所和京熙大学批准的动物护理机构指南和研究方案，对小鼠进行饲养、繁殖和治疗。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
通过LRRK2对Rab GTPases进行磷酸化。一利用45个Rab GTPase进行的体外LRRK2激酶分析得到的代表性磷酸化图像和commassie brilling blue（CBB）染色凝胶图像。蓝色箭头和红色箭头分别表示LRRK2自动磷酸化和Rab磷酸化。b条Rab磷酸化水平根据CBB染色的每个Rab的蛋白质水平和LRRK2自身磷酸化水平进行标准化。磷酸化程度是彩色编码的：红色为强磷酸化，绿色为边缘磷酸化。数据为平均值±SD(n个 = 3).c（c）利用Rab1a、3c、8a和35进行LRRK2体外激酶分析的代表性磷酸化图像和CBB染色凝胶图像

图2
Rab磷酸化位点的鉴定。一(顶部)LRRK2磷酸化的Rab8a的串联质谱（MS/MS）光谱表明T72是磷酸化位点。(底部)下划线文本表示MS/MS的序列覆盖率。磷酸化位点用带星号的红色表示。b条Rab GTPases中LRRK2磷酸化位点周围的局部氨基酸序列比对。磷酸化位点用星号表示。氨基酸是彩色编码的：蓝色的脂肪族氨基酸、红色的极性氨基酸、绿色的酸性氨基酸、紫色的碱性氨基酸和黄色的芳香族氨基酸。**c（c）**通过MS/MS鉴定磷酸化位点的验证。在每种Rab（Rab1a T75A或T75D；Rab3c T94A或T94D，Rab8a T72A或T72D；Rab35 T72A或T72D）的磷酸缺乏或拟磷酸突变体存在下进行的LRRK2体外激酶测定的代表性磷酸图像和CBB染色凝胶图像

图3
细胞中LRRK2与Rab的相互作用和LRRK2中Rab的磷酸化。一LRRK2和Rab蛋白的共免疫沉淀。用myc标记的LRRK和V5标记的Rab1a、3c、8a或35共同转染人胚胎肾（HEK）-293细胞，并使用抗myc或V5抗体进行免疫沉淀，然后进行western blot分析。（b-c）在HEK-293细胞中通过LRRK2验证Rab磷酸化。通过western blot分析监测Rab和/或LRRK2的表达和磷酸化，并监测肌动蛋白水平作为负荷对照。如方法所述，通过针对与Rab1a中LRRK2位点对应的磷酸肽产生的磷酸化特异性Rab抗体（p-Rab）来检测Rab磷酸化。对于b条，细胞被单独转染LRRK2野生型（WT）（每组中描述为“无”）或与Rab1a、8a或35的WT或磷酸突变体（TA或TD）一起转染。对于**c（c）**，细胞单独转染Rab1a、8a或35（所有WT）（每组中描述为“无”）或与LRRK2的WT或突变体（G2019S或D1994A）一起转染。d日用MLi-2（1μM）、LRRK2-IN-1（1μM）或载体对照物处理NIH-3T3细胞，并使用抗p-Rab和抗pLRRK2（磷酸-丝氨酸935）抗体通过western blot分析监测内源性Rab和内源性LRRK_2的磷酸化。**e（电子）**野生型和野生型内源性Rab的磷酸化*Lrrk2号机组*击倒老鼠。WT和*Lrrk2号机组*用所示抗体对基因敲除小鼠进行westernblot分析。所有结果都是来自三个独立实验的代表性斑点

图4
LRRK2-诱导磷酸化对Rab GTP结合能力的调节。一,b条Rab1a、3c、8a和35的GTP结合分析。在一用Rab1a、3c、8a或35的野生型（WT）或磷酸化突变体（TA或RD）转染HEK-293细胞。在b条，HEK-293细胞单独转染Rab1a、3c、8a或35（所有WT）（每组中描述为“无”）或与LRRK2的WT或突变体（G2019S或D1994A）一起转染。在一和b条，细胞裂解物与γ-氨基己基-GTP琼脂糖孵育，GTP-结合的Rab经SDS-PAGE进行western blot分析。显示了具有代表性的免疫印迹图像(顶部)GTP-结合Rab水平的量化(底部)来自三个独立的实验。数据为平均值±SD(n个 = 3). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001; 单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较事后检验

图5
Rab的磷突变体在初级皮层神经元中诱导神经毒性。一,b条胚胎第15.5天，在DIV 7用野生型（WT）或myc-tagged LRRK2或GFP-conjugated Rab（Rab1a、3c、8a或35）突变体转染皮质神经元。在转染后的指定时间点固定神经元，并用抗-myc（对于用LRRK2构建体转染的细胞）或抗-GFP（对于用Rab构建体转染的细胞）抗体进行免疫染色以鉴定转染的细胞。代表性图片(一)和神经突长度的量化(b条)如图所示。数据表示三个值的平均值±SD(一)或五个(b条)独立实验，在任何一个实验中，每个结构至少分析20个神经元

图6
LRRK2底物Rab GTPases在初级皮层神经元中诱导的神经毒性。一,b条胚胎第15.5天，在DIV 7处转染皮质神经元，如图5所示，并固定在2处(一)或7天(b条)转染后。用抗myc（针对转染LRRK2结构体的细胞）或抗GFP（针对转导Rab结构体的电池）抗体对神经元进行免疫染色，以鉴定转染的细胞。还对神经元进行TUNEL免疫染色，并对TUNEL阳性神经元进行计数，并以表达感兴趣构建体的总神经元的百分比表示。数据是来自六个独立实验的平均值±SD，在任何一个实验中，每个结构至少分析40个神经元*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001; 单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较事后检验

图7
Rab35的磷酸突变体诱导黑质多巴胺能神经元变性。一腺相关病毒（AAV）介导的Rab35野生型（WT）或磷酸化突变体（T72A或T72D）递送后3周，黑质中的酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色。注射AAV eGFP作为对照。b条,**c（c）**TH-的量化(b条)和Nissl-阳性(**c（c）**)对侧和同侧黑质神经元。数据为平均值±SD(n个 = 5). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，以及****第页 < 0.0001，无统计学意义；单向方差分析，然后是Tukey的事后分析。比例尺，1 mm

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1. Greggio E、Jain S、Kingsbury A、Bandopadhyay R、Lewis P、Kaganovich A、van der Brug MP、Beilina A、Blackinton J、Thomas KJ等。突变型LRRK2/dadarin的毒性作用需要激酶活性。神经生物学疾病。2006;23:329–341. doi:10.1016/j.nbd.20006.04.001。-内政部-公共医学

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LRRK2对Rab GTPases磷酸化的失调诱导神经退行性变

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