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。2018;14（4）：567-583。
doi:10.1080/15548627.2018.1429874。 Epub 2018年2月21日。

在小鼠胚胎成纤维细胞中，睫状体蛋白RPGRIP1L独立于其睫状体基底部蛋白酶体调节功能控制自噬

安德烈亚斯·斯特拉赫特鲁普 1, 安东尼娅·维格林 1, 比约恩鹳 2, 乌尔里希·吕瑟 1, 克里斯托弗·格哈特 1
附属公司

在小鼠胚胎成纤维细胞中，睫状体蛋白RPGRIP1L独立于其睫状体基底部蛋白酶体调节功能控制自噬

安德烈亚斯·斯特拉赫特鲁普等。 自噬。 2018。

摘要

此前，宏观自噬/自噬被证明除其他外受初级纤毛的调节。RPGRIP1L的突变导致纤毛功能障碍，导致严重的人类疾病，概括为纤毛病。最近，我们发现RPGRIP1L缺乏导致小鼠睫状体基底部蛋白酶体活性降低。重要的是，在缺乏RPGRIP1L的情况下，药物诱导的蛋白酶体活性恢复并不能挽救睫状体长度的改变，这表明RPGRIP1 L也通过其他机制影响睫状体功能。基于这一知识，我们分析了Rpgrip1l阴性小鼠胚胎的自噬。在这些胚胎中，由于MTOR复合物1（MTORC1）的激活增加，自噬活性降低。在Rpgrip1l缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞中，应用MTORC1抑制剂雷帕霉素挽救了失调的MTORC1、自噬活性和纤毛长度，但没有挽救蛋白酶体活性，这表明Rpgrip1l似乎相互独立地调节自噬和蛋白酶体活性。

关键词：MAP1LC3B；MTOR；SHH；细胞大小；纤毛；纤毛长度；睫状体病；蛋白酶体；雷帕霉素。

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数字

图1。
图1。
RPGRIP1L缺乏导致自噬活性降低。野生型和非野生型ATG5的（A至Aii）免疫荧光染色Rpgrip1升-负MEF。通过标记F-ACT（Phalloidin 488，绿色）显示细胞，通过标记TUBG（蓝色）显示细胞和细胞核。ATG5阳性自噬体呈红色（n=3）。比例尺：5µm。定量ATG5阳性囊泡的数量（Ai）或ATG5阴性囊泡面积与总细胞面积（Aii）的比值。每个细胞中ATG5阳性小泡的数量和面积显著减少。野生型和非野生型MEF的（B to Bii）免疫荧光染色Rpgrip1升-阴性小鼠胚胎。通过标记F-ACT（Phalloidin 488，绿色）显示细胞，通过标记TUBG（蓝色）显示细胞和细胞核。自噬体用MAP1LC3B染色（红色）（n=4）。比例尺：5µm。定量MAP1LC3B阳性囊泡数量（Bi）或MAP1LC3阳性囊泡面积与总细胞面积（Bii）之比。每个细胞中MAP1LC3B阳性小泡的数量和面积显著减少。（C） MEF中MAP1LC3B-II的Western blot分析（n=3）。MAP1LC3B-II的量减少Rpgrip1升-负MEF。（D） 对饥饿24小时（包括6小时CQ治疗）的MEF血清进行自噬通量测定（n=4）。通过CQ处理抑制溶酶体融合导致野生型MAP1LC3B-II的积累，而非野生型Rpgrip1升-MEF不足。（E） 对MEFs血清饥饿和CQ处理6小时（n=8）进行自噬流量测定。通过CQ处理抑制溶酶体融合导致野生型MAP1LC3B-II的积累，但在Rpgrip1升-MEF不足。（F） 基于免疫荧光的OFD1作为自噬底物的野生型和Rpgrip1升-MEF不足。轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）染色，OFD1用红色（n=3）染色。比例尺：概述中为2.5µm，插图中为1µm。OFD1的数量在转速抓地力1l−/−MEF公司。（G） 基于免疫荧光定量的野生型和转速抓地力1l−/−MEF（n=6）。轴丝用Ac-TUBA（绿色）标记，基体用TUBG（蓝色）标记，BBS4用红色染色。比例尺：1µm。在底部发现的BBS4数量Rpgrip1升-纤毛缺陷明显减少。（A到G）星号表示具有统计意义的差异。p.d.u.，程序定义单位。
图2。
图2。
RPGRIP1L缺陷导致MTORC1信号上调。（A） MEF中磷酸化-（Ser2448）-MTOR的蛋白质印迹研究（n=3）。磷酸化-（Ser2448）-MTOR的量在Rpgrip1升-负MEF。非磷酸化MTOR用于标准化，而ACT用作负荷控制。（B） 基于免疫荧光的野生型和转速抓地力1l−/−肢芽细胞。用TRITC Phalloidin标记的F-ACT对细胞进行可视化，以监测细胞大小（在两种情况下：n=4）。为了更好地可视化，对相同的细胞进行了描述，既没有细胞大小指示，也有细胞大小指示（黄色虚线）。单元格大小转速抓地力1l−/−肢体芽细胞明显增多。（C） 半定量PCR分析Hif1a型MTORC1信令的目标（n=3）。的表达式Hif1a型几乎翻了一番Rpgrip1升-MEF不足。为了更好地显示DNA条带，凝胶电泳照片被颜色反转。（D） 基于免疫荧光的野生型和Rpgrip1升-用二甲基亚砜（对照）或雷帕霉素处理的阴性MEF。轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）染色，OFD1用红色染色（n=4）。比例尺：1µm。雷帕霉素处理导致两种基因型的睫状体基底部OFD1数量显著减少。（A到D）星号表示具有统计意义的差异。（D） 最重要的显著差异用粗体书写。
图3。
图3。
RPGRIP1L缺陷不是通过控制SHH信号而是通过控制AKT1信号来调节自噬。（A） TSC1的Western blot研究（n=3）。TSC1的金额在Rpgrip1升-与野生型同胞相比，MEF不足。ACT用作加载控制。（B） 磷酸化-（Ser939）-TSC2的蛋白质印迹研究。非磷酸化TSC2用于标准化，而ACT用作负荷控制（n=3）。与野生型和Rpgrip1升-MEF不足。非磷酸化TSC2用于归一化，ACT用作负载控制。（C） 磷酸化-（Ser473）-AKT1的蛋白质印迹研究。非磷酸化AKT1用于归一化，而ACT用作负荷控制（n=3）。磷酸化-（Ser473）-AKT1的量在转速抓地力1l−/−MEF公司。（D） 野生型MEFs的免疫荧光研究。图片是使用3D-SIM获得的。睫状体轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）染色。磷酸-（Ser473）-AKT1呈红色，位于野生型MEF的初级纤毛。比例尺：1µm。（E） 基于免疫荧光的野生型和Rpgrip1升-MEF中纤毛缺陷。轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）和磷酸化AKT1（Ser473）染色为红色（n=3）。比例尺：1µm。磷酸化-（Ser473）-AKT1的数量在转速控制1升−/−MEF公司。（F） 野生型MEF的免疫荧光研究。图片是使用3D-SIM获得的。睫状体轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）染色。Phospho-（Ser2448）-MTOR呈红色，位于野生型MEF初级纤毛的底部。比例尺：1µm。（G） 基于免疫荧光的野生型和Rpgrip1升-MEF中纤毛缺陷。轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）和磷酸化-（Ser2448）-MTOR染色为红色（n=3）。比例尺：1µm。磷酸化-（Ser2448）-MTOR的量在转速抓地力1l−/−MEF公司。（H） 定量实时逆转录酶-PCR研究第1部分经SAG处理Rpgrip1升-与SAG处理的野生型MEF相比，MEF不足（n=3）。相对归纳法第1部分在里面Rpgrip1升-不足的MEF减少了约60%。（一） 野生型和野生型的免疫荧光研究Rpgrip1升-GLI1过度表达后MEF缺陷。通过标记F-ACT（Phalloidin 405，蓝色）观察细胞，ATG5染色为红色（n＝3）。在单通道图像中，F-ACT染色显示为白色，以在黑色背景和F-ACT标记的细胞轮廓之间提供高对比度。比例尺：5µm。在野生型MEF中用表达GLI1的质粒转染后，ATG5的数量增加，而在GLI1过度表达后，ATG的数量保持不变Rpgrip1升-MEF不足。（J） 野生型和Rpgrip1升-用表达GLI1的质粒转染后出现MEF缺陷。纤毛用Ac-TUBA标记（红色），BBS4用蓝色标记（n=3）。比例尺：1µm。野生型MEFs中GLI1过表达后BBS4的量增加，而野生型MEFs中GLI1转染后BBS4的量保持不变Rpgrip1升-MEF不足。（C到J）星号表示具有统计意义的差异。（I和J）最重要的显著差异用粗体书写。
图4。
图4。
在缺乏RPGRIP1L的情况下，药物治疗可挽救自噬活性和睫状体长度。（A至C）基于免疫荧光的纤毛长度定量。（A） 雷帕霉素治疗后睫状体长度的测量。野生型和Rpgrip1升-施用雷帕霉素（n=3）后，缺乏的MEF减少。（B） 在野生型MEF中应用自噬抑制剂3-MA可延长纤毛，但不能Rpgrip1升-MEF不足。睫状轴丝以Ac-TUBA（绿色）标记，基底体以TUBG（蓝色）标记（野生型n=4；野生型n=5转速抓地力1l−/−MEF）。比例尺：1µm。（C） 应用自噬激活剂ABT-737减少野生型和Rpgrip1升-MEF不足。睫状轴丝用Ac-TUBA（绿色）染色，基底体用TUBG（蓝色）染色（野生型n=4；野生型n=5Rpgrip1升−/−MEF）。比例尺：1µm。星号表示统计学上的显著差异。最重要的显著差异用粗体书写。（A和C）用二甲基亚砜处理细胞作为载体对照。
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这项工作得到了德国联邦科学技术研究所（Sonderforschungsbereiche 590和612）的支持。