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.2018年1月4:8:948。
doi:10.3389/fphar.2017.00948。 2017年电子收集。

丹皮酚通过AMPK/mTOR信号通路上调自噬对血管平滑肌细胞增殖的抗动脉粥样硬化作用

吴宏飞 1 2, 宋爱伟 1, 胡文军（Wenjun Hu） 1, 民代 1 2
附属公司

丹皮酚通过AMPK/mTOR信号通路上调自噬对血管平滑肌细胞增殖的抗动脉粥样硬化作用

吴宏飞等。 前沿药理学. .

摘要

简介：丹皮酚（2'-羟基-4'-甲氧基苯乙酮）是从牡丹皮中分离出来的一种活性成分，已被证明对血管平滑肌细胞（VSMC）具有抗动脉粥样硬化和抗增殖作用。然而，与自噬相关的丹皮酚在防止VSMC增殖中的可能作用尚未阐明。材料和方法：在apoE中评估了丹皮酚的动脉粥样硬化保护作用-/-老鼠。通过对载脂蛋白E培养基层α-SMA和LC3II斑点染色，观察丹皮酚对VSMC增殖和自噬的影响-/-小鼠。采用CCK8和BrdU分析研究丹皮酚对细胞增殖的影响在体外通过免疫印迹分析检测LC3II积累和p62降解来评估VSMC中的自噬水平。为了研究丹皮酚是否可以通过自噬诱导来阻止VSMC增殖，我们通过抑制自噬来测试自噬和细胞增殖的变化。通过免疫印迹分析检测AMPK/mTOR通路在自噬调节中的水平。AMPK抑制剂和si-AMPK转染VSMC用于确认AMPK活性是否在丹皮酚的自噬调节中起关键作用。结果：体内实验证实，丹皮酚抑制动脉粥样硬化的发展，并减少载脂蛋白E介质层中的血管平滑肌细胞数量-/-老鼠。丹皮酚增加了LC3II的蛋白水平和动脉中层存在的自噬体，这意味着丹皮酚可能诱导VSMC自噬体内丹皮酚具有抑制ox-LDL诱导的增殖的潜力在体外实验。丹皮酚剂量依赖性地促进酸性囊泡细胞器和自噬体的形成，上调LC3II的表达，增加p62降解。自噬抑制剂CQ明显减弱丹皮酚诱导的VSMC自噬和抗增殖作用。此外，丹皮酚诱导AMPK磷酸化并降低mTOR磷酸化。AMPK抑制剂逆转了丹皮酚诱导的p-mTOR/mTOR降低。丹皮酚可诱导血管平滑肌细胞的LC3II转化，增加p62降解并抑制细胞增殖，其作用被si-AMPK所消除。结论：这些结果表明，丹皮酚通过上调自噬和激活AMPK/mTOR信号通路抑制VSMC的增殖，为丹皮酚的抗动脉粥样硬化活性提供了新的见解。

关键词：AMPK/mTOR通路；丹皮酚；动脉粥样硬化；自噬；细胞增殖。

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数字

图1
图1
丹皮酚对载脂蛋白E中动脉粥样斑块形成的影响-/-老鼠。（A）动脉的面部油红O（ORO）染色和定量。钢筋=3 mm，n个= 5.（B）H&E染色和斑块面积量化。巴=500μm。（C）动脉粥样硬化病变的ORO染色。棒材=500μm。数据为平均值±标准差。∗∗P（P）与对照组相比<0.01，#P（P）< 0.05,##P（P）与模型组相比<0.01。Pae-H，400 mg/kg体重的丹皮酚。Pae-M，200 mg/kg体重的丹皮酚。Pae-L，100 mg/kg体重的丹皮酚。
图2
图2
丹皮酚诱导血管平滑肌细胞自噬并抑制apoE细胞增殖-/-老鼠。（A）解剖动脉并用于共聚焦免疫荧光分析。自噬标记LC3II（红色）与平滑肌标记α-SMA（绿色）的典型共焦荧光图像。棒材=100μm。（B）平滑肌面积的量化。（C）小鼠动脉中层PCNA的蛋白表达。（D）总结了LC3II与α-SMA在小鼠动脉中层的共定位系数。（E）小鼠动脉中层LC3II的蛋白表达。数据为平均值±SD，n个= 3.∗∗P（P）< 0.01,∗P（P）与对照组相比<0.05，#P（P）< 0.05,##P（P）与模型组相比<0.01。（F）小鼠动脉中层的电镜分析。黑色箭头表示自噬体。Bar=200 nm。Pae-H，400 mg/kg体重的丹皮酚。Pae-M，200 mg/kg体重的丹皮酚。Pae-L，100 mg/kg体重的丹皮酚。
图3
图3
丹皮酚治疗通过ox-LDL刺激阻止VSMC增殖和DNA合成。（A）不同浓度的ox-LDL对VSMC增殖的影响，如CCK8分析所评估的。（B）在没有或存在ox-LDL（50μg/mL）的情况下，用指示浓度的丹皮酚（7.5–240μM）处理VSMC 24小时。用CCK8法检测细胞活力。（C）BrdU法检测细胞增殖。数据为平均值±SD，n个=3。∗第页< 0.05,∗∗第页与对照组相比<0.01。#第页< 0.05,##第页与ox-LDL组相比<0.01。
图4
图4
丹皮酚治疗可防止VSMC的细胞周期进展。在不含或含有ox-LDL（50μg/mL）的情况下，用不同浓度的丹皮酚处理VSMC 24 h，然后用PI对细胞核进行染色，并用流式细胞仪进行分析。给出了三个独立实验的汇编评估。数据为平均值±SD，n个= 3.∗∗第页与对照组相比<0.01。##第页与ox-LDL组相比<0.01。
图5
图5
丹皮酚诱导VMSCs自噬。在没有或存在ox-LDL（50μg/mL）的情况下，用不同浓度的丹皮酚处理细胞24小时。荧光显微镜显示细胞中AO染色，Bar=50μm（A）和流式细胞术（B）.（C）自噬值计算为AO的百分比+与单元格总数相关的单元格。（D）通过红到绿（FL3/FL1）平均荧光强度计算细胞内酸化。（E）LC3处理和（F）western blot检测VSMC中p62水平。数据为平均值±SD，n个= 3.∗∗第页与对照组相比<0.01。#第页< 0.05,##第页与ox-LDL组相比<0.01。（G）VSMC的典型TEM图像。箭头表示自噬体。条形=500 nm。
图6
图6
丹皮酚通过诱导VSMC自噬抑制ox-LDL诱导的细胞增殖。（A）在没有或存在CQ的情况下用丹皮酚处理的ox-LDL诱导的VSMC中LC3处理的代表性斑点。（B）CCK8法检测VSMC增殖情况。（C）LC3阳性点占细胞总面积的百分比。（D）p62阳性点占细胞总面积的百分比。数据为平均值±标准差，n个= 3.∗第页< 0.05,∗∗第页< 0.01.（E）LC3（红色）和DAPI染色的免疫荧光代表性图像。（F）p62（绿色）和DAPI染色的免疫荧光的代表性图像。棒材=50μm。（G）VSMC的TEM图像。箭头表示自噬体。条形=500 nm。
图7
图7
丹皮酚通过AMPK/mTOR信号通路诱导VSMC自噬。（A）在没有或存在rap的情况下，用丹皮酚处理的VSMC中p-mTOR/mTOR的代表性斑点。p-AMPK/AMPK的代表性斑点（B）和p-mTOR/mTOR（C）在不存在或存在化合物C的情况下用丹皮酚处理的ox-LDL诱导的VSMC中。（D）AMPK敲除的免疫印迹验证。LC3II的代表性斑点（E）和第62页（F）在用ox-LDL和丹皮酚处理的VSMC或si-AMPK转染细胞中。（G）通过红到绿（FL3/FL1）平均荧光强度计算细胞内酸化。（H）通过CCK8分析VSMC增殖。数据为平均值±SD，n个= 3.∗第页< 0.05,∗∗第页< 0.01.
图8
图8
丹皮酚对载脂蛋白E动脉中层APMK/mTOR表达的影响-/-老鼠。AMPK的蛋白表达（A）和mTOR（B）在小鼠动脉中层。数据为平均值±标准差，n个= 3.∗∗第页与对照组相比<0.01。##第页与模型组相比<0.01。（C）丹皮酚靶向AMPK的分子对接。
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