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。2018年2月；38(2):353-362.
doi:10.1161/ATVBAHA.117.309571。 Epub 2017年12月28日。

生长分化因子6通过抑制血管内皮生长因子信号传导促进血管稳定性

什洛莫·克里斯宾 1, 琥珀N斯特拉曼 1, 蔡斯·H·梅利克 1, Radu V Stan公司 1, 马泰奥·马林韦诺 1, 杰米·格莱克伦 1, 丹尼尔·卡斯特拉诺娃 1, 伊丽莎白·德贾纳 1, 布兰特·M·温斯坦 2
附属公司

生长分化因子6通过抑制血管内皮生长因子信号传导促进血管稳定性

什洛莫·克里斯宾等。 动脉硬化血栓血管生物。 2018年2月。

摘要

目标：功能性血管系统的组装需要从激活到成熟的协调和动态过渡。高血管内皮生长因子活性促进激活，包括连接不稳定和细胞运动。成熟涉及连接稳定和功能性内皮屏障的形成。大多数情况下，修复信号的特性和作用机制尚不清楚。骨形态发生蛋白受体及其配体在胚胎血管组装和成熟过程中具有重要功能。先前的研究表明生长分化因子6（GDF6；骨形态发生蛋白13）在血管完整性中的作用，尽管GDF6的作用机制尚不清楚。因此，我们试图进一步探讨GDF6在血管稳定中的需求。

方法和结果：我们研究了GDF6在斑马鱼体内和体外培养的人脐静脉内皮细胞中促进内皮血管完整性的作用。我们报告GDF6通过抵消血管内皮生长因子活性促进血管完整性。GDF6缺乏的内皮细胞增加了血管内皮生长因子信号转导，增加了血管血管内皮钙粘附素Y658磷酸化，血管内皮钙黏附素从细胞-细胞界面的去定位，并削弱了容易发生血管渗漏的内皮细胞黏附连接。

结论：我们的结果表明GDF6通过抑制血管内皮生长因子信号传导促进血管稳定。了解GDF6如何影响血管完整性可能有助于深入了解人类出血和相关血管病变。

关键词：骨形态发生蛋白受体；钙粘蛋白；生长分化因子6；人脐静脉内皮细胞；血管内皮生长因子A。

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数字

图1
图1。GDF6功能丧失导致血管完整性受损体内
(A类)2 dpf斑马鱼胚胎的清晰图像，红色方框表示面板B和C中的图像区域(B、 C类)整个底座就地2dpf野生型斑马鱼胚胎中干杂交研究gdf6a（B） 或gdf6b型（C） ●●●●。WM-ISH在3个生物重复中进行，每个实验组至少有10个胚胎。(D、 E类)约1.5 dpf年龄匹配野生型（D）与gdf6a第327页突变体（E）动物Tg（kdrl:gfp）背景显示节段间血管正常生长和形态。(F、 G公司)整个2 dpf野生型同胞（F）或gdf6a第327页突变体（G）动物，在gdf6a第327页突变体。(H（H）)量化2 dpf野生型同胞的百分比（24个单独离合器中的0/2106，0%）或gdf6a第327页突变体动物206/837只，分布在24个单独的离合器中，占25%），显示躯干出血。(I–N型)2 dpf野生型同胞（I–K）或gdf6a第327页突变体（L–N）Tg（kdrl:gfp），Tg（gata:dsRed）双转基因动物。血管呈绿色荧光（I、K、L、N），红细胞呈红色荧光（J、K、M、N）。渗出的红细胞在gdf6a第327页突变体（M中的箭头）。(O、 P（P）)透射光图像，显示2 dpf控制器（O）或gdf6a（P） 注射吗啡肽的动物，整体形态正常，但躯干出血（星号）gdf6a变形体。149/149或100%的对照组注射吗啡肽的动物没有出现躯干出血，而32/134或24%的对照组gdf6a在3个单独的实验中，注射吗啉的动物出现躯干出血。(Q–V（Q–V）)代表性透射光（Q，T），绿色共焦Tg（kdrl:gfp）2 dpf野生型兄弟（Q–S）的（R，U）和红色共焦Qdot655纳米晶体（S，V）图像，或gdf6a第327页突变体（T–V）Tg（kdrl:gfp）转基因动物血管内注射Qdot655纳米晶。容器的大量Qdot655泄漏在gdf6a第327页突变体（V中的箭头）。(W公司)量化2 dpf野生型同胞的百分比（在两个单独的实验中为0/11，0%）或gdf6a第327页突变动物（两个单独实验中的8/11，73%）表现出Qdot655纳米晶注入循环的泄漏。(X（X）)2 dpf百分比的量化hsp:m樱桃色-注入（两个单独实验中的12/39，31%；）或hsp:gdf6a-2a-樱桃色-注入（两个单独实验中的11/142，8%）gdf6a第327页1 dpf热休克的突变动物显示躯干出血。野生型的表达gdf6a抑制gdf6a第327页突变表型。所有图像均为侧视图，左侧为嘴侧视图。在面板B、C、G–L和P–U中，比例尺为70µm，在面板m和N中为100µm；在面板D和E中为1 mm。
图2
图2。GDF6功能丧失导致血管完整性受损在体外
(A类)来自人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的GDF6和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（G3PDH；负荷对照）的RT-PCR，这些细胞用对照siRNA（“对照”，第1列）或靶向GDF6的两种不同siRNA之一（“GDF6#1”和“GDF6#2”，第2和第3列）处理。两种以GDF6为靶点的siRNA都降低了GDF6转录水平，但siRNA#2更有效。从3个独立实验中观察到的结果。(B类)TaqMan分析定量对照或GDF6 siRNA处理的HUVEC细胞中的GDF6转录水平（两种siRNA串联使用以确保所有实验的最大基因抑制效率），显示GDF6 siRNA处理HUVEC中GDF6的转录水平降低了90%以上。(C类)HUVEC单层渗透性分析示意图。简单地说，HUVEC接种在完全生长介质（i）中的跨阱室的内阱中。细胞附着在膜上并形成细胞-细胞粘附，在添加染料之前在膜上组装融合单层（ii）。FITC-右旋糖酐被添加到跨阱室的内腔中，当细胞-细胞粘附完整时，大部分残留在内腔中（iii）。内皮细胞-细胞粘附缺陷导致单层通透性增加，FITC-右旋糖酐外渗增加。外孔中的荧光强度与单层渗透性的程度成正比（iv）。(D类)量化通过HUVEC单层转移的FITC数量，表示为在没有任何添加的HUVEC细胞（即无细胞对照）的情况下通过膜转移的染料数量的百分比。对照siRNA处理的HUVEC单层将FITC转移减少到无细胞条件的约10%，但用GDF6 siRNA处理HUVEC导致通透性增加3.5倍。用可溶性GDF6蛋白或抗VEGFA抗体治疗可降低GDF6 siRNA敲除引起的通透性增加。在3个单独的实验中发现了等效结果。(E类)通过HUVEC单层转移的FITC数量的量化，表示为通过控制HUVEC单层的膜转移的染料数量的百分比。VEGFA治疗导致单层通透性增加，而S1P治疗导致单层渗透性降低。qPCR数据（B组）来自至少3个生物重复序列，每个探针有3个技术重复序列。渗透性分析（面板D和E）作为3个生物重复进行，每个实验条件至少有3个技术重复。数据来自单个生物复制。
图3
图3。GDF6功能丧失导致VEGFR2增加
(A类)示意图显示，VEGF激活导致VEGFR2受体上酪氨酸1175磷酸化，导致ERK激活（磷酸化），进而促进内皮细胞运动和增殖增加。(B类)使用乙醚控制siRNA或GDF6 siRNA处理的HUVEC提取物，用于测量磷酸化（Tyr 1175）VEGFR2或总VEGFR2蛋白水平与α-微管蛋白负荷控制的代表性蛋白质印迹图像在体外. (C类)使用来自控制siRNA或GDF6 siRNA处理的HUVEC的提取物，量化磷酸化（Tyr 1175）VEGFR2和归一化为a-微管蛋白负荷对照的VEGFR2总蛋白水平在体外蛋白质水平表示为对照siRNA处理量的百分比。(D类)定量对照siRNA或GDF6 siRNA处理的HUVEC中的总VEGFR2蛋白水平，对照siRNA处理或用重组GDF6蛋白处理，归一化为a-微管蛋白负荷对照。蛋白质水平表示为对照siRNA处理量的百分比。(E类)TaqMan分析定量对照或GDF6 siRNA处理的HUVEC细胞中的VEGFR2转录水平，显示GDF6 siRNA处理HUVEC中VEGFR2的转录水平大约增加了3.5倍。(F类)TaqMan分析定量36 hpf野生型同胞或gdf6a第327页突变动物，表现出1.6倍的增长血管内皮生长因子受体2转录水平。(G、 H（H）)整个底座就地36dpf野生型同胞（G）和gdf6a第327页探索突变（H）动物血管内皮生长因子受体2显示血管表达增加。图像为侧视图，左侧为嘴侧视图。比例尺=50µm。Western blot结果来自2–3个独立的生物重复序列。每个生物重复序列中的蛋白裂解物对每个抗体进行两次印迹（两次技术重复）。qPCR数据来自至少3个生物重复序列，每个探针有3个技术重复序列。WM-ISH在3个生物重复中进行，每个实验组至少有10个胚胎。
图4
图4。GDF6功能丧失导致ERK激活增加
(A类)使用乙醚对照siRNA或GDF6 siRNA处理的HUVEC提取物，用于测量磷酸化ERK1/2（Thr 202，Tyr 205）或总ERK1/2蛋白质水平与α-管蛋白负荷对照的代表性蛋白质印迹图像在体外. (B类)使用对照siRNA或GDF6 siRNA处理的HUVEC提取物，对磷酸化ERK1/2（Thr 202，Tyr 205）和总ERK1/2蛋白水平进行量化，并将其归一化为α-管蛋白负荷对照在体外蛋白质水平表示为对照siRNA处理量的百分比。(C–F类)2 dpf野生型同胞（C，D）或gdf6a第327页突变体（E，F）Tg（kdrl:gfp）用磷酸-ERK1/2（Thr 202，Tyr 205）抗体进行免疫染色的转基因斑马鱼（绿色；面板C，D）。（红色；面板C–F）。(G公司)2dpf中磷酸化ERK1/2轴向血管荧光强度的定量Tg（kdrl:gfp）用磷酸-ERK1/2（Thr 202，Tyr 205）抗体对转基因斑马鱼进行免疫染色。图像为侧视图，左侧为嘴侧视图。比例尺为5µm。Western blot结果显示至少有3个独立的生物重复。每个生物重复序列中的蛋白裂解物对每个抗体进行两次印迹（两次技术重复）。p-Erk1/2的IHC在3个生物重复中进行，每个实验组至少有10个胚胎。
图5
图5。GDF6功能丧失导致内皮细胞-细胞连接形成缺陷，但不会增加细胞死亡
(A–D)野生型同胞动物背主动脉内皮细胞的透射电镜照片。图像显示了背主动脉壁上两个不同内皮细胞之间的连接界面（面板A、C和D中的假彩色为蓝色和红色）。面板B显示了面板a中方框区域的放大图像，而面板D显示了面板C中内皮细胞-细胞界面的放大图像。野生型内皮细胞膜在其细胞-细胞接口处紧密相连，具有丰富的明显的电子致密连接复合体（面板B和D中的红色箭头）。(E–H（E–H）)大鼠背主动脉内皮细胞的透射电镜照片gdf6a第327页突变动物。图像显示背主动脉壁中两个不同内皮细胞之间的连接界面（在面板E、G和H中以蓝色和红色突出显示）。面板F显示了面板E中方框区域的放大图像，而面板H显示了面板G中内皮细胞-细胞界面的放大图像。与野生型同胞中的内皮细胞界面相比，突变内皮细胞膜通常看起来不太紧密（面板F和H中的红色箭头），具有较少的电子密度结合络合物（面板F中的红色箭头）。(我)野生型同胞或正常人背主动脉内皮细胞透射电镜下内皮细胞-细胞连接平均长度的量化gdf6a第327页突变动物。所有透射电子显微照片均来自躯干（和背主动脉）的横截面。面板A、C、E、G中的标尺为500 nm，面板B、D、F、H中的标杆为250 nm。使用5个野生型和10个突变胚胎的背主动脉图像进行形态测量，以确定连接的形态特征。(J–M公司)2 dpf背主动脉的共焦图像Tg（kdrl:egfp）转基因野生型同胞（J，L）或gdf6a第327页突变型（K，M）caspase 3免疫染色动物，显示绿色食品计划（绿色）和caspase 3（红色）染色（J，K）或仅caspase 2染色（红色；L，M）。箭头指向caspase 3阳性细胞。白色虚线表示主动脉的边界。对2个独立实验中的至少5个野生型和突变胚胎进行免疫染色和成像分析，结果一致。
图6
图6。GDF6功能丧失导致VE-Cadherin失稳
(A类)示意图显示，VEGF激活导致VE-Cadherin（VECDN）上酪氨酸658（Y658）磷酸化，从而导致VECDN内化和降解。(B类)western blot的代表性图像用于测量VECDN总蛋白水平和α-微管蛋白负荷控制，使用野生型同胞的蛋白提取物，非出血gdf6a第327页突变体，或gdf6a第327页躯干出血突变体。(C类)使用野生型同胞、非出血性同胞的蛋白质提取物，对归一化为α-微管蛋白负荷对照的VECDN总蛋白水平进行量化gdf6a第327页突变体，或gdf6a第327页躯干出血突变体。(D类)western blot的代表性图像用于测量磷酸化VECDN（Y658）或总VECDN蛋白水平与α-微管蛋白负荷对照，使用来自HUVEC细胞的蛋白提取物处理对照siRNA或两种不同GDF6 siRNA中的一种。(E类)使用用对照siRNA或两种不同GDF6 siRNA中的一种处理的HUVEC细胞的蛋白提取物，定量磷酸化VECDN（Y658）或归一化为a-微管蛋白负荷对照的VECDN总蛋白水平。蛋白质水平以对照siRNA处理量的级分表示。(F–O公司)内皮单层中对照组（F–J）或GDF6（K–O）siRNA-处理的HUVEC的典型共焦图像，使用PECAM抗体（灰色-F，K）、总VECDN抗体（红色-G，I，L，N）和磷酸化-VECDN抗体（绿色-H，J，M，O）进行免疫荧光染色。面板H、J、M、O分别是面板G、I、L、N中装箱区域的放大视图。PECAM和VECDN图像显示GDF6 siRNA处理的HUVEC中细胞-细胞连接染色减少，但一些剩余连接处的磷酸化-VECDN（Y658）染色较强。(P–U型)内皮单层中对照HUVEC的代表性共焦图像，未经任何处理（P，Q）、VEGFA重组蛋白（R，S）或S1P（T，U）过夜，然后使用针对总VECDN（红色，P–U）和磷酸-VECDN（Y658）（绿色，Q，S，U）的抗体进行免疫荧光染色。磷酸化VECDN（Y658）和VECDN总量（Q，S，U）的合并图像显示了它们的相对定位模式。Western blot结果显示至少有2个独立的生物重复。每个生物重复序列中的蛋白裂解物对每个抗体进行两次印迹（两次技术重复）。免疫印迹分析至少进行2次生物复制，每个实验条件下至少进行2个技术复制，每个复制分析5张图像。(V（V）)GDF6在内皮屏障形成中的作用模型。GDF6活性抑制VEGF活性，促进内皮连接稳定。GDF6功能丧失（LOF）导致VEGF信号增加，VECDN磷酸化、内化和降解增加，内皮屏障功能降低。
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参考文献

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