Therapeutic effects of conditioned medium from bone marrow-derived mesenchymal stem cells on epithelial-mesenchymal transition in A549 cells

doi:10.3892/ijmm.2017.3284

。2018年2月；41(2):659-668.

doi:10.3892/ijmm.2017.3284。 Epub 2017年11月24日。

骨髓间充质干细胞条件培养液对A549细胞上皮-间充质转化的治疗作用

王欣¹, 高俊玲¹, Man-Man Zhao先生¹, 朱慧欣¹, 燕霞田¹, 冉丽¹, 小华江¹, 雷雨¹, 景瑞田¹, 崔建中²

附属机构

PMID： 29207055
预防性维修识别码：项目编号：5752235
内政部： 10.3892/ijmm.2017.3284

骨髓间充质干细胞条件培养液对A549细胞上皮-间充质转化的治疗作用

王欣等。国际分子医学杂志。 2018年2月。

。2018年2月；41（2）：659-668。

doi:10.3892/ijmm.2017.3284。 Epub 2017年11月24日。

作者

王欣¹, 高俊玲¹, Man-Man Zhao先生¹, 朱慧欣¹, 燕霞田¹, 冉丽¹, 小华江¹, 雷雨¹, 景瑞田¹, 崔建中²

附属机构

¹华北科技大学基础医学院，唐山，河北063210。
²中国河北省唐山市唐山工人医院神经外科，邮编063000。

PMID： 29207055
预防性维修识别码：项目编号：5752235
内政部： 10.3892/ijmm.2017.3284

摘要

肺纤维化是一种慢性肺部疾病。转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad3信号通路在肺纤维化的发病机制中起着重要作用。骨髓源性间充质干细胞（BMSCs）已被证明是纤维化途径分子方面的调节剂。然而，来自骨髓间充质干细胞的条件培养基（BMSCs-CM）是否抑制上皮-间充质转化（EMT）过程尚不清楚。本研究证实了BMSCs-CM通过抑制Smad3的磷酸化对人类II型肺泡上皮细胞（A549）发挥抗纤维化作用的假说。我们使用体外A549细胞通过相控显微镜检测EMT的形态学证据。将这些细胞随机分为4组：对照组、TGF-β1组、SIS3（Smad3特异性抑制剂）组和BMSCs-CM组。免疫荧光法测定E-钙粘蛋白（E-钙黏蛋白；E-cad）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和p-Smad3的位置。western blot检测E-cad、CK8、α-SMA、波形蛋白、p-Smad3、蜗牛1、I型胶原（COLI）和III型胶原（collagen III）的表达水平。在暴露于TGF-β1后，A549细胞显示出纺锤状成纤维细胞样形态。根据这些形态学变化，E-cad和CK8的表达水平下调，而α-SMA和波形蛋白的表达水平上调。随着这一过程，p-Smad3、Snail1、COLI和COLIII的表达水平增加。然而，BMSCs-CM组和SIS3组的细胞显示α-SMA和vimentin水平降低（TGF-β1上调），E-cad和CK8表达水平升高（TGF--β1下调）。总的来说，这些结果表明BMSCs CM抑制了EMT，这可能与TGF-β1/Smad3有关。本研究为研究肺部疾病的发病机制提供了理论依据。

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数字

图1
在倒置相差显微镜下观察BMSCs的形态（放大倍率，×200）（A）原始细胞。（B）第一代BMSC。（C）第二通道BMSCs。（D）第三通道BMSCs。骨髓间充质干细胞，骨髓源性间充质细胞。

图2
倒置相差显微镜下观察到的细胞形态（放大倍数×200）。对照组包括具有鹅卵石样上皮形态、圆形或多边形的A549细胞。TGF-β1组包括表现出纺锤状细长成纤维细胞样形态的细胞。SIS3组和BMSCs-CM组的细胞形态相似；TGF-β1诱导的形态学改变受到抑制。细胞组如下：对照组，细胞培养在无血清DMEM中；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加；在5 ng/ml TGF-β1暴露前添加BMSCs-CM、BMSCs-CM。骨髓间充质干细胞；CM，条件培养基；TGF-β1，转化生长因子-β1。

图3
EMT的超微结构证据。正常A549细胞可以通过细胞质中LBs的存在来识别。TGF-β1组LBs变性、肿胀、空泡。箭头表示LB；放大倍数，×7000。细胞组如下：对照组，细胞培养在无血清DMEM中；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加；在5 ng/ml TGF-β1暴露前添加BMSCs-CM、BMSCs-CM。Nu，细胞核；LB，层状体；上皮-间充质转化；转化生长因子-β1。

图4
在倒置相差显微镜下观察EMT过程中细胞的迁移能力。A549电池（1×10⁴)8日播种μm孔径的Transwell培养箱，然后用5 ng/ml的TGF-β1刺激48 h，有或没有SIS3和BMSCs-CM。细胞组如下：对照组，细胞培养在无血清DMEM中；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加；在5 ng/ml TGF-β1暴露前添加BMSCs-CM、BMSCs-CM。骨髓间充质干细胞；CM，条件培养基；上皮-间充质转化；TGF-β1，转化生长因子-β1。

图5
评估上皮细胞标记物E-cad和CK8以及间充质细胞标记物α-SMA和波形蛋白在A549细胞中的表达。Western blot分析检测细胞中E-cad、CK8、α-SMA和波形蛋白的水平。以β-肌动蛋白为对照的蛋白质表达密度分析。结果表明，暴露于TGF-β1后，BMSCs-CM或SIS3显著增加E-cad和CK8的表达，并降低α-SMA和波形蛋白的表达(^*与对照组相比P<0.05；^#与TGF-β1组相比P<0.05）。棒材标签如下：A，对照组；B、 TGF-β1组；C、 SIS3组；D、BMSCs-CM组。细胞组如下：对照组，细胞培养在无血清DMEM中；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加；在5 ng/ml TGF-β1暴露前添加BMSCs-CM、BMSCs-CM。骨髓间充质干细胞；CM，条件培养基；转化生长因子-β1；E-cad、E-钙黏蛋白；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白。

图6
通过免疫荧光染色确定，E-cad和α-SMA在A549细胞中共定位。细胞质中存在E-cad（绿色），FITC-染色；α-SMA（红色）存在于细胞质中，经TRITC染色。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺，40μm.细胞组如下：对照组，细胞在无血清DMEM中培养；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加；在5 ng/ml TGF-β1暴露前添加BMSCs-CM、BMSCs-CM。E-cad、E-cadherin（E-钙黏蛋白）；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；TRITC，四甲基罗丹明异硫氰酸酯；异硫氰酸荧光素；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

图7
A549细胞中p-Smad3、Smad3和Snail1表达水平的评估。Western blot分析检测细胞中p-Smad3、Smad3和Snail1的水平。以β-肌动蛋白为对照的蛋白质表达密度分析。结果表明，BMSCs-CM或SIS3治疗可显著降低TGF-β1暴露后p-Smad3和Snail1的表达(^*与对照组相比P<0.05；^#与TGF-β1组相比P<0.05）。棒材标签如下：A，对照组；B、 TGF-β1组；C、 SIS3组；D、BMSCs-CM组。细胞组如下：对照组，细胞培养在无血清DMEM中；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加。在5 ng/ml TGF-β1暴露前添加BMSCs-CM、BMSCs-CM。骨髓间充质干细胞；CM，条件培养基；TGF-β1，转化生长因子-β1。

图8
评估细胞中COLI和COLIII的表达水平。使用蛋白质印迹分析来检测细胞中COLI和COLIII的水平。以β-肌动蛋白为对照的蛋白质表达的密度分析。结果表明，BMSCs-CM或SIS3显著降低TGF-β1暴露后COLI和COLIII的表达(^*与对照组相比P<0.05；^#与TGF-β1组相比P<0.05）。棒材标签如下：A，对照组；B、 TGF-β1组；C、 SIS3组；D、BMSCs-CM组。细胞组如下：对照组，细胞培养在无血清DMEM中；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加。骨髓间充质干细胞；CM，条件培养基；转化生长因子β1；COLI、胶原蛋白I。

图9
免疫荧光显示，p-Smad3在细胞中定位。p-Smad3显示为红色，经TRITC染色；用DAPI对细胞核进行反染色显示为蓝色。比例尺，50μm.细胞组如下：对照组，细胞在无血清DMEM中培养；TGF-β1，在无血清DMEM中培养的细胞，暴露于5 ng/ml TGF-；SIS3，用3μM SIS3（Smad3的特异性抑制剂），在5 ng/ml TGF-β1暴露前4 h添加。TRITC，四甲基罗丹明异硫氰酸盐；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚。

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