Upregulation of Myelin Gene Expression by a Physically-Modified Saline via Phosphatidylinositol 3-Kinase-Mediated Activation of CREB: Implications for Multiple Sclerosis

doi:10.1007/s11064-017-2435-1

.2018年2月；43(2):407-419.

doi:10.1007/s11064-017-2435-1。 Epub 2017年11月15日。

通过磷脂酰肌醇3-激酶介导的CREB活化，物理修饰盐上调髓鞘基因表达：对多发性硬化的意义

马拉本杜·贾纳¹, Supurna Ghosh公司², 卡利帕达·巴汉^三

附属公司

¹拉什大学医学中心神经科学系，地址：1735 West Harrison St，Suite 310，Chicago，IL，60612，USA。
²Revalesio Corporation，1200 East D Street，Tacoma，WA，98421，美国。
^三拉什大学医学中心神经科学系，地址：1735 West Harrison St，Suite 310，Chicago，IL，60612，USA。Kalipada_Pahan@rush.edu。

PMID： 29143164
预防性维修识别码：项目编号：5799355
内政部： 2007年10月10日/11064-017-2435-1

通过磷脂酰肌醇3-激酶介导的CREB活化，物理修饰盐上调髓鞘基因表达：对多发性硬化的意义

马拉本杜·贾纳等。神经化学研究. 2018年2月.

.2018年2月；43(2):407-419.

doi:10.1007/s11064-017-2435-1。 Epub 2017年11月15日。

作者

马拉本杜·贾纳¹, Supurna Ghosh公司², 卡利帕达·巴汉^三

附属公司

¹拉什大学医学中心神经科学系，地址：1735 West Harrison St，Suite 310，Chicago，IL，60612，USA。
²Revalesio Corporation，1200 East D Street，Tacoma，WA，98421，美国。
^三拉什大学医学中心神经科学系，地址：1735 West Harrison St，Suite 310，Chicago，IL，60612，USA。Kalipada_Pahan@rush.edu。

PMID： 29143164
预防性维修识别码：项目编号：5799355
内政部： 2007年10月10日/11064-017-2435-1

摘要

中枢神经系统（CNS）再髓鞘化增加和CNS炎症减少是阻止多发性硬化（MS）进展的重要步骤。RNS60是一种生物活性水溶液，在氧气压力升高的情况下，将生理盐水置于Taylor-Couette-Poiseuille流中产生。最近，我们证明RNS60具有抗炎特性。在这里，我们描述了RNS60的早幼化特性。RNS60，而不是生理盐水（NS）、RNS10.3（不含过量氧气的TCP修饰盐水）或PNS60（不含TCP修饰的含过量氧气的盐水），刺激髓鞘特异性基因和蛋白质（髓鞘碱性蛋白，MBP；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，MOG和蛋白脂蛋白，PLP）的表达原代小鼠少突胶质细胞和混合胶质细胞。在研究机制时，我们发现RNS60治疗诱导少突胶质细胞中cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的激活，最终导致CREB募集到髓鞘特异性基因的启动子。此外，RNS60激活1A型p110β/α，但不激活1B型p110γ，磷脂酰肌醇-3（PI-3）激酶，取消RNS60介导的CREB激活，LY294002（PI-3激酶的特异性抑制剂）上调髓磷脂基因表明RNS60通过激活PI3激酶上调CREB的激活和少突胶质细胞中髓鞘特异性分子的表达。这些结果突出了RNS60的一种新的早幼髓鞘特性，可能对MS和其他脱髓鞘疾病有益。

关键词：CREB；髓磷脂基因；少突胶质细胞；PI-3激酶；生理盐水。

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数字

图1
RNS60对原代小鼠少突胶质细胞髓鞘基因表达的影响。在无血清条件下用RNS60、PNS、RNS10.3和NS处理细胞6小时，然后用半定量RT-PCR分析MBP、PLP和MOG mRNA(一)和定量实时PCR(b条). 结果就是手段 ± 三个不同实验的SD。第页 < 0.005与对照组相比。在无血清条件下用不同浓度（2，5，10%v/v）的RNS60处理细胞6 h，然后用半定量RT-PCR分析MBP，PLP和MOG mRNA(c)和定量实时PCR(d日). 结果是平均值 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组

图2
RNS60对原代小鼠少突胶质细胞髓鞘特异性蛋白表达的影响。在无血清条件下，用不同浓度（2，5，10%v/v）的RNS60处理细胞18 h，然后用western blot监测PLP和MBP的蛋白水平(一). Actin作为加载控件运行。扫描条带，并显示与对照组相关的数值（PLP/actin和MBP/actin）(b条). 结果是平均值 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组。细胞也被抗GalC和PLP抗体双重标记(c). 在整个研究过程中，显微镜设置保持不变。图是三个独立实验的代表

图3
RNS60以剂量和时间依赖性的方式诱导小鼠混合胶质细胞中髓鞘基因和蛋白的表达。在无血清条件下用不同浓度的RNS60或NS处理细胞6 h，然后用半定量RT-PCR分析MBP、PLP和MOG mRNA(一)和定量实时PCR(b条). RNS60或NS处理18 h后，通过Western blot检测PLP和MBP的蛋白水平(c). Actin作为加载控件运行。扫描条带，并将数值（PLP/Actin和MBP/Actin）作为对照(d日). 结果是平均值 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组。用10%v/v的RNS60处理细胞不同的时间间隔，然后用western blot监测MBP和PLP的蛋白水平(**e（电子）**). 扫描条带，并将数值（PLP/Actin和MBP/Actin）作为对照(**（f）**). RNS60处理18 h后，通过western blot检测GFAP、PLP和MBP的蛋白水平(克). 扫描条带，并将数值（PLP/Actin、MBP/Actin和GFAP/Actin）作为对照(小时). 结果就是手段 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组

图4
CREB在RNS60介导的原代小鼠少突胶质细胞髓鞘基因增加中的作用。在无血清条件下用10%v/v RNS60或NS刺激不同分钟后，制备细胞裂解物，并用抗磷酸化CREB和总CREB抗体进行Western blotting分析(一). 对条带进行扫描，并将值（P-CREB/CREB）表示为相对于对照(b条). 结果就是手段 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组。在无血清条件下用10%v/v RNS60刺激不同分钟后，检测核提取物的EMSA(c). 结果代表了三个独立的实验。用CREB siRNA转染细胞，并使用Lipofectamine Plus和nupherin试剂控制siRNA。转染24小时后，在无血清条件下用10%v/v RNS60处理细胞6小时，然后用半定量RT-PCR监测MBP和MOG的mRNA表达(d日)和实时PCR(**e（电子）**). 结果是平均值 ± 三个单独实验的SD。^一第页<0.001与对照组相比；^b条第页<0.001与对照-RNS60

图5
RNS60治疗诱导原代小鼠少突胶质细胞中CREB向MBP基因启动子募集。一显示了小鼠MBP基因启动子中两个CRE的位置。细胞在无血清培养基中用10%v/v RNS60处理2 h。然后通过半定量扩增免疫沉淀染色质片段(b条CRE-直径；cCRE-最大值）和定量(d日CRE-直径；**e（电子）**CRE近端）PCR，如“材料和方法”中所述。结果是平均值 ± 三个单独实验的SD。^一第页<0.001与对照组

图6
RNS60治疗诱导原代小鼠少突胶质细胞中CREB向MOG基因启动子募集。一显示了小鼠MOG基因启动子中两个CRE的位置。细胞在无血清培养基中用10%v/v RNS60处理2 h。然后通过半定量扩增免疫沉淀染色质片段(b条CRE-直径；cCRE-最大值）和定量(d日CRE-直径；**e（电子）**CRE-最大值）PCR，如“材料和方法”所述。结果是平均值 ± 三个单独实验的SD。^一第页<0.001与对照组

图7
PI3K在RNS60介导的CREB激活和原代小鼠少突胶质细胞髓鞘特异性基因表达中的作用。在无血清条件下用RNS60处理细胞30分钟，然后用western blot监测细胞膜组分中p110α、p110β和p110γ的水平(一). 对条带进行扫描，数值以相对密度表示(b条). 结果就是手段 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组。在无血清条件下，用10%v/v RNS60处理不同浓度LY294002（LY）预孵育30分钟的细胞。刺激30分钟后，EMSA监测CREB的激活(c). 刺激6h后，通过半定量RT-PCR监测PLP、MBP和MOG的mRNA表达(d日)和实时PCR(**e（电子）**). 结果就是手段 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组相比；^b条第页<0.001与对照-RNS60；^c 第页与对照-RNS60相比，<0.01。刺激18 h后，用western blot检测PLP蛋白水平(**（f）**). 扫描条带，并将数值（PLP/Actin）表示为相对于对照(克). 结果就是手段 ± 三个不同实验的SD。^一第页<0.001与对照组相比；^b条第页与对照组-RNS60相比，<0.001；^c 第页与对照-RNS60相比，<0.01。小时在无血清条件下，用10%v/v RNS60处理预先用LY或沃特曼（wortmannin）培养30分钟的少突胶质细胞。治疗18小时后，细胞被抗MOG和PLP抗体双重标记(克). 图是三个独立实验的代表

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