Apobec2 deficiency causes mitochondrial defects and mitophagy in skeletal muscle

doi:10.1096/fj.201700493R

。2018年3月；32(3):1428-1439.

doi:10.1096/fj.201700493R。 Epub 2018年1月3日。

Apobec2缺乏导致骨骼肌线粒体缺陷和有丝分裂

附属机构

¹日本东京宇都宫大学农业生物学和生物资源系。
²日本福冈九州大学动物与海洋生物资源科学系。
^三日本东京农业科技大学农业科学联合研究生院。
⁴英国剑桥分子生物学实验室医学研究委员会。

PMID： 29127187
预防性维修识别码：项目经理5892721
内政部： 10.1096/fj.201700493R

Apobec2缺乏导致骨骼肌线粒体缺陷和有丝分裂

佐藤由介等。美国财务会计准则委员会J。 2018年3月。

。2018年3月；32(3):1428-1439.

doi:10.1096/fj.201700493R。 Epub 2018年1月3日。

附属机构

¹日本东京宇都宫大学农业生物学和生物资源系。
²日本福冈九州大学动物与海洋生物资源科学系。
^三日本东京农业科技大学农业科学联合研究生院。
⁴英国剑桥分子生物学实验室医学研究委员会。

PMID： 29127187
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内政部： 10.1096/fj.201700493R

摘要

Apobec2是在分化骨骼肌和心肌中表达的激活诱导脱氨酶/载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽胞苷脱氨酶家族的成员。我们以前曾报道过小鼠Apobec2缺乏导致肌纤维类型改变、肌病和肌肉质量减少。然而，Apobec缺乏引起肌病的机制及其生理功能尚不清楚。在这里，我们表明，虽然Apobec2定位于小鼠组织和培养的肌管中的肌节Z线，但Apobec2-缺陷肌肉中的肌瘤结构不受影响。相反，电子显微镜显示线粒体增大，线粒体被自噬空泡吞噬，表明Apobec2缺乏导致线粒体缺陷，导致骨骼肌中的线粒体吞噬增加。事实上，Apobec2缺乏导致活性氧生成增加和线粒体去极化，导致线粒体吞噬作为防御反应。此外，Apobec2的运动能力^-/-小鼠受损，这意味着Apobec2缺乏会导致持续的肌肉功能障碍。10个月大的小鼠肌纤维中存在边缘空泡，这表明慢性肌肉损伤损害了正常的自噬功能。我们的结论是，Apobec2缺乏会导致线粒体缺陷，从而增加肌肉有丝分裂，导致肌病和萎缩。我们的研究结果表明，Apobec2是线粒体稳态维持正常骨骼肌功能所必需的-Sato，Y.、Ohtsubo，H.、Nihei，N.、Kaneko，T.、Sato，Y-、Adachi，S.-I.、Kondo，S.、Nakamura，M.、Mizunoya，W.、Iida，H..、Tatsumi，R.、Rada，C.、Yoshizawa，F.Apobec2缺乏导致骨骼肌线粒体缺陷和有丝分裂。

关键词：亚太经合组织；线粒体；肌病。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者感谢西野一藏博士（日本东京国家神经病学精神病学中心）和菅直人博士（日本新泻市新泻大学）在有丝分裂和肌病方面提供的技术建议和有益讨论，以及藤田裕弘博士、铃原邦彦博士（宇都宫大学）和池桥义平博士（九州大学）感谢他们的支持和有益的建议。作者感谢已故同事迈克尔·纽伯格的原创贡献。这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部科学研究补助金（25850218）的支持；森那加·侯世凯（Morinaga Hoshikai）；中关村基金会；和尤哈拉纪念基金会。作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
Apobec2定位于肌节Z线，但其缺乏不会改变小鼠肌肉中的肌节结构。一个–*H（H）*)15周龄大鼠TA肌纵切面的免疫染色*Apobec2型*^−/−抗Apobec2抗体小鼠(一个,B)，α-肌动蛋白(C,D类)，Apobec2+α-肌动蛋白(E类,F类)和MyHC(*G公司*,*H（H）*).我–N个)WT和WT原代培养肌管的免疫染色*阿波贝克2*^−/−抗Apobec2抗体小鼠(我,J型)，α-肌动蛋白(*K（K）*,*L（左）*)和Apobec2+α-肌动蛋白(*M（M）*,N个).一个,B,我,J型)对Apobec2蛋白的抗体特异性。E类,*M（M）*)Apobec2在Z线中的定位。C–*H（H）*,*K（K）*–N个)Apobec2缺乏未引起肌节结构改变。比例尺，5μm。

**图2。**
Apobec2缺乏导致骨骼肌线粒体缺陷。一个)15周龄WT和WT大鼠比目鱼肌（慢型）和EDL（快型）的超微结构分析*阿波贝克2*^−/−用电子显微镜观察小鼠。一个)一,b条)箭头表示比目鱼肌肌纤维间线粒体拉长，嵴致密*阿波贝克2^−/−*老鼠；WT小鼠未发现这种线粒体。*c（c）*,d日)箭头表示线粒体周围有自噬体样空泡(*c（c）*)比目鱼肌中异常的肌下膜线粒体*阿波贝克2^−/−*老鼠(d日).e（电子）,*（f）*)大鼠EDL肌线粒体增大*阿波贝克2^−/−*老鼠；WT小鼠未发现这种线粒体。比例尺，2μm。B)组织学分析以表征Apobec2缺乏对15周龄WT和WT骨骼肌线粒体的影响*阿波贝克2*^−/−老鼠。一,b条)TA肌肉的Gomori三色染色显示线粒体受损，原因是TA肌细胞液中存在粗糙的红色纤维*阿波贝克2*^−/−老鼠。*c（c）*–*（f）*)比目鱼肌和EDL的NADH-TR染色显示肌下膜线粒体厚而密，细胞质中排列不规则且较粗糙的区域*Apobec2型^−/−*。克,小时)比目鱼肌抗TOM20免疫染色显示*阿波贝克2*^−/−老鼠。比例尺，100μm。C)线粒体呼吸或解偶联基因相对于*Actb公司*（参考基因）在15周龄WT和*阿波贝克2*^−/−老鼠。D类)15周龄大鼠比目鱼肌线粒体oxphos（ATP5A、UQCR2、COX I、SDHB和NDUFB8）和UCP3的免疫印迹分析*阿波贝克2*^−/−小鼠正常化为α-微管蛋白。E类)图表示归一化为α-微管蛋白的相对表达水平**P（P）*< 0.05 (n个=每组3个）。F类)线粒体DNA(*二氧化碳百万吨*)是相对于*18秒*rRNA作为核基因组DNA的控制。*G公司*)的表达式*第1a部分*和帕德WT和WT比目鱼肌中的mRNA阿波贝克2^−/−小鼠相对于*Actb公司*（参考基因）。*H（H）*)15周龄WT和WT TA肌肉线粒体TCA代谢物相对丰度*阿波贝克2*^−/−毛细管电泳质谱法测定小鼠。数据为平均值±扫描电镜. **P（P）*< 0.05 (n个=每组4个）。

**图3。**
Apobec2缺乏导致骨骼肌ROS增加和线粒体去极化。一个)15周龄WT和WT TA肌肉的组织学DHE和DAPI荧光*阿波贝克2*^−/−老鼠。细胞核中氧化的DHE显示荧光红色。比例尺，100μm。B)WT和WT肌管JC-1染色*阿波贝克2*^−/−JC-1聚集体和单体分别呈现红色（健康）和绿色（去极化）荧光。比例尺，100μm。C,D类)代表DHE荧光面积的图表一个(C)和JC-1的总面积B(D类). 数据为平均值±扫描电镜. ****P（P）*< 0.001.E类)WT和WT肌管分离的细胞液中Apobec2、MF20、CytoC和GAPDH（作为内部对照）的免疫印迹分析*阿波贝克2*^−/−图表示标准化为GAPDH的相对CytoC表达水平。A.U.，任意单位**P（P）*< 0.05.

**图4。**
在*阿波贝克2^−/−*肌肉。一个)自噬相关基因在15周龄WT和TA肌肉中的表达*阿波贝克2*^−/−老鼠(n个=每组4）相对于*Actb公司*mRNA表达作为参考基因。图表表示平均值±扫描电镜. **P（P）*< 0.05.B)对15周龄WT和WT TA肌肉中poly-Ub、p62、PINK1、Parkin和LC3B（LC3B-II/LC3B-I）的免疫印迹分析*阿波贝克2*^−/−老鼠。图表示LC3B-II/LC3B-I比率、poly-Ub、p62、PINK1和Parkin水平归一化为α-微管蛋白。波段是3个独立实验的代表性图像。HMW，高分子量**P（P）*< 0.05.C)15周龄C57Bl/6和*阿波贝克2*^−/−正常小鼠（中间）或隔夜不进食的小鼠（底部）中含有抗多聚-Ub（顶部）和抗LC3B。从50个随机选择的肌纤维中量化的LC3B阳性点刺的数量总结为直方图。D类)用抗Tom20和抗LC3B抗体对一只15周龄WT小鼠和一只*阿波贝克2*^−/−鼠标。用Tom20对LC3B阳性点状细胞进行结肠镜检表明*阿波贝克2^−/−*鼠标。E类)15周龄WT和对照组比目鱼肌中PDHE1α、CytoC和Tom20的免疫印迹分析*阿波贝克2*^−/−老鼠。图表示归一化为α-微管蛋白的相对表达水平**P（P）*< 0.05 (n个=每组3个）。F类)15周龄WT和WT比目鱼肌Mfn1、Fis1、Opa1和BNIP3的免疫印迹分析*阿波贝克2*^−/−老鼠。图表示归一化为α-微管蛋白的相对表达水平**P（P）*< 0.05 (n个=每组3个）。*G公司*)用MyHC-slow（红色）和LC3B（绿色）对15周龄WT和*Apobec2型*^−/−老鼠。插图显示了慢肌纤维（*）和快肌纤维（#）的示例。*H（H）*)比目鱼肌每个区域的纤维总数（来自4只小鼠的数据）。我)MyHC慢阴性小鼠的MyHC慢阳性（红色）和其他肌纤维的平均横截面积（CSA）(n个= 4).J型)根据MyHC类型，肌肉切片中抗LC3B染色的相对强度。

**图5。**
肌纤维*阿波贝克2^−/−*老鼠在年老时会积累有边缘的空泡。3周龄、15周龄和10月龄大鼠TA肌肉横截面的苏木精和伊红染色*阿波贝克2*^−/−肌肉。箭头表示15周龄和10周龄的中心核*阿波贝克2*^−/−肌纤维。箭头表示10个月大的边缘液泡*阿波贝克2*^−/−肌纤维。用LC3B抗体对10个月龄的肌肉进行免疫染色，显示阳性结构*阿波贝克2*^−/−肌纤维（白色箭头）。比例尺，100μm。

**图6。**
运动能力受损*阿波贝克2^−/−*老鼠。在15周龄的WT和*阿波贝克2*^−/−小鼠驯化3d后。老鼠以每分钟2米的速度以10%的坡度奔跑，直到它们在5秒内无法爬上跑步机，尽管有负面奖励（电击）。时间(一个)，速度(B)、和距离(C)已记录。工作(D类)和权力(E类)按个体体重归一化计算。所有图表均表示平均值±东南方. **P（P）*< 0.05 (n个=每组4个）。

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