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。2017年10月；16(4):5363-5369.
doi:10.3892/mmr.2017.7243。 Epub 2017年8月14日。

过度表达的microRNA-506和microRNA124通过靶向krüppel-like因子4/5减轻H2O2诱导的人心肌细胞功能障碍

张秀洲 1, 刘福燕 2, 王庆庆 三, 耿玉雪 1
附属公司

过度表达的microRNA-506和microRNA124通过靶向krüppel-like因子4/5减轻H2O2诱导的人心肌细胞功能障碍

张秀洲等。 分子医学代表。 2017年10月。

摘要

KLüppel-like因子（KLFs）调节多种细胞功能并调节病理过程。在本研究中，研究了微RNA（miRs）在H2O2诱导的人心肌细胞（HCM）损伤中的翻译后机制。在H2O2培养的HCM细胞中，通过流式细胞术测量活性氧和凋亡细胞。转染miR‑506/‑124模拟物和抑制剂以诱导miR‑）506/−124功能的获得或丧失。用MTT法分析细胞增殖。目标基因通过生物信息学算法进行预测，并通过双荧光素酶报告分析进行确认。分别通过逆转录聚合酶链反应分析和western blotting检测mRNA和蛋白质表达水平。结果表明，H2O2可显著诱导HCM细胞凋亡，并增加活性氧（ROS）浓度。H2O2显著上调了HCM中KLF4和KLF5的表达水平，下调了miR‑506和miR-124的表达水平。此外，生物信息学分析显示，HCM中KLF4和KLF5的3’-非翻译区内存在潜在的miR‑506和miR-124结合位点。miR-506和miR-124的过度表达抑制了H2O2诱导的HCM中KLF4和KLF5的上调。miR-506和miR-214的过度表达逆转了H2O2诱导的HCM细胞凋亡和ROS增加。总之，miR-506和miR-214的过度表达被证实通过抑制KLF4和KLF5的表达对H2O2诱导的HCM损伤具有保护作用。

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数字

图1。
图1。
H（H）2O（运行）2-HCM中诱导的细胞毒性、凋亡和活性氧。（A） HCM与H孵育2O（运行）2用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵法检测细胞活力。（B） HCM与H孵育2O（运行）224h，流式细胞仪检测TUNEL染色。（C） 在HCM暴露于H后测量LDH水平2O（运行）224小时（D）根据DCF（DCF-DA的氧化衍生物）的荧光强度变化，在用h处理12小时后，测量细胞内ROS的生成2O（运行）2值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。HCM，人心肌细胞；TUNEL，三磷酸镍标记；乳酸脱氢酶；活性氧，活性氧；DCF-DA，二氯二氢荧光素二乙酸酯。
图2。
图2。
H（H）2O（运行）2调节HCM中KLF4和KLF5的表达。KLF4和KLF5的mRNA表达水平受H调节2O（运行）2（200µM）。采用逆转录定量聚合酶链反应分析法检测不同时间点（A）KLF4和（B）KLF5的mRNA表达。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。KLF，类krüppel因子。
图3。
图3。
miR-506和miR-124在H2O（运行）2-孵化HCM。（A） 用H治疗的HCM中差异表达miR的无监督分层聚类2O（运行）2通过microRNA微阵列分析测定24小时。使用MeV软件（4.2.6版）绘制输出。逆转录定量聚合酶链反应分析测定了转染（B）miR-506和（C）miR-124模拟物和抑制剂的HCM中miR-506,miR-124。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05。HCM，人心肌细胞；miR，microRNA；控制；NC，阴性对照。
图4。
图4。
miR-506和miR-124针对HCM中的KLF4/5。（A） 人miR-506在KLF4-wild和KLF5-wild 3′-UTR上的推测结合位点。（B） 人miR-124在KLF4-wild和KLF5-wild 3′-UTR上的推测结合位点。在双核糖核酸酶报告子分析中，用插入（C）KLF4-wild和KLF5-wild 3′-UTR的萤火虫荧光素酶报告子或插入（D）KLF4-Mut和KLF5-Mut 3′-UTR的报告子转染人心肌细胞。在转染后24小时，评估相对荧光素酶活性。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05。KLF，类krüppel因子；野生型；Mut，突变体；3′-UTR，3′-非翻译区；miR，microRNA；NC，阴性对照。
图5。
图5。
miR-506和miR-124的过度表达抑制H细胞凋亡和ROS2O（运行）2-孵化HCM。过度表达（A）miR-506和（B）miR-124对KLF4或KLF5的mRNA表达水平没有影响。在miR-506和miR-124转染后24小时，用western blot分析测定（C）KLF4和KLF5，以及（D）caspase-3和caspase-9的蛋白表达水平。当（E）miR-506和（F）miR-124过度表达时，根据DCF在h存在下12 h的荧光强度变化来测量细胞内ROS的产生2O（运行）2DCF-DA的氧化衍生物。数值表示为平均值±标准偏差（每组n=3）*与对照组相比，P<0.05。miR，microRNA；KLF，类krüppel因子；活性氧，活性氧；DCF-DA，二氯二氢荧光素二乙酸酯。
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