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.2017年6月29日；37（14）：e00632-16。
doi:10.1128/MCB.00632-16。 2017年7月15日印刷。

Mrhl长非编码RNA通过调节Sox8表达介导小鼠精原细胞减数分裂承诺

Shubhangini Kataruka公司 1, 维杰·苏雷什·阿哈德 1, 巴瓦娜·凯亚尔 1, Manchanahali R Satyanarayana Rao先生 2
附属公司

Mrhl长非编码RNA通过调节Sox8表达介导小鼠精原细胞减数分裂承诺

Shubhangini Kataruka公司等。 分子细胞生物学. .

摘要

长非编码RNA（lncRNAs）是包括精子发生在内的各种生物过程的重要调节器。我们以前的研究揭示了mrhl公司RNA和Wnt信号，其中mrhl公司RNA负调控Wnt信号，并在Wnt信号激活时下调。这种下调mrhl公司RNA对精原细胞的减数分裂进程至关重要。在我们目前的研究中，我们确定转录因子Sox8是mrhl公司RNA表达、Wnt信号传导激活和减数分裂进展。与其他小组的报告相比，我们报告了Sox8在生殖细胞中的表达，并描述了其分子机制Sox8指数由监管mrhl公司精原细胞分化过程中的RNA。的绑定mrhl公司RNA到Sox8指数启动子伴随着其他调控因子的组装，这些调控因子涉及Myc-Max-Mad转录因子、辅抑制因子Sin3a和辅激活因子Pcaf。在Wnt信号的背景下，Sox8直接调节减数分裂前和减数分裂标记的表达。精原细胞中Wnt信号的长期激活导致整体染色质结构的改变和干细胞标记物水平的降低。

关键词：Myc-Mad-Max；Sin3A；Sox8；Wnt信号；mrhl RNA。

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数字

图1
图1
Sox8和Sox9在小鼠睾丸中的表达。Sox8和α-微管蛋白蛋白质印迹来自不同的凝胶。对于Sox8杂交，P7和P21之间的间隔是由于切除了一条蛋白质标记通道。（A和B）Sox8（A）和Sox9（B）在以Pou5f1为精原细胞标记的7日龄小鼠睾丸和以Scp3为精母细胞标记的21日龄小鼠睾丸中的表达。（C和D）Sox8（C）和Sox9（D）在7日龄和21日龄小鼠睾丸中的表达，以波形蛋白作为Sertoli细胞的标记物。（E） 的表达式分析Sox8指数和Sox9指数在P7和P21小鼠睾丸中。（F） Western blot显示Sox8在P7和P21小鼠睾丸中表达。面板E中的数据绘制为平均值±标准偏差（SD）(n个= 4). **,P（P）≤ 0.01; *,P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。棒材，25μm。
图2
图2
Wnt3a条件培养基处理后Gc1-Spg和TM4细胞中Sox8上调。（A） Sox8在Gc1-Spg和TM4细胞系中的表达和定位。（B） Sox8沉默后Gc1-Spg细胞的免疫荧光分析，以显示所用抗体的特异性。（C） 的表达式分析Sox8指数和Sox9指数Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg和TM4。Ctrl，control。（D） 荧光素酶测定Sox8指数和Sox9指数对照组和Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞中的启动子。（E） Western blot显示Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg和TM4细胞中Sox8上调。面板C和D中的数据绘制为平均值±SD(n个= 4). **,P（P）≤ 0.01; *,P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。棒材（A和B），25μm。
图3
图3
Tcf4结合位点在Sox8指数Wnt中的启动子介导的Sox8的上调。（A） 基因组结构Sox8指数.双向启动子Sox8指数，其相邻基因，以及Tcf4结合位点和mrhl公司描述了RNA结合位点。（B） 琼脂糖凝胶（1.5%），显示用于ChIP实验的声波DNA的大小范围。（C和D）Tcf4（C）和β-catenin（β-cat）（D）ChIP，显示其在索克斯8含有Tcf4结合位点（bp−800）的基因启动子选择性地激活Wnt信号。P7睾丸代表Wnt再表达状态，而P21睾丸代表Wnt-激活状态。抄送1（bp−300）用作阳性对照，而β-actin基因（bp−250）用作阴性对照。（E） Tcf4和β-catenin在Sox8指数沉默后含有Tcf4结合位点（bp−800）的基因启动子mrhl公司RNA。（F） 使用含有1 kb上游启动子区的质粒构建物对经对照培养基或Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞进行荧光素酶检测Sox8指数具有野生型Tcf4结合位点或突变的Tcf4连接位点。面板C至F中的数据绘制为平均值±SD，n个= 4. ***,P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）<0.05（双尾学生t吨测试）。N.S，不显著。
图4
图4
分析的作用mrhl公司Wnt介导的Sox8上调中的RNA。（A） 的表达式分析mrhl公司RNA和索克斯8对照组和Wnt3A调节介质处理的Gc1-Spgmrhl公司RNA过度表达（OE）和mrhl公司RNA沉默（si）。pcDNA，载体控制。（B） 荧光素酶检测Sox8指数对照中的启动子和Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spgmrhl公司RNA过度表达和mrhl公司RNA沉默。数据绘制为平均值±SD，n个= 4. ***,P（P）≤ 0.001; **,P（P）≤ 0.01; *,P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。
图5
图5
c-Myc与Sox8指数Wnt信号激活时Myc-Max-Mad结合位点的启动子。（A） Sox8基因1-kb上游启动子与CAAT盒、Tcf4结合位点的结构，mrhl公司RNA结合位点和推测的转录因子与结合位点一起被鉴定。（B） c的表达分析-Myc公司,马克斯、和疯狂Gc1-Spg细胞（对照，Wnt3A条件培养基处理）。（C） Gc1-Spg细胞和小鼠睾丸中的C-Myc ChIP计算机辅助设计作为c-Myc占用的阳性对照。中bp−500到−700的区域Sox8指数启动子作为阴性对照。（D） c的表达分析-Myc公司和索克斯8在对照组和Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg中c-Myc沉默后。（E） ChIP显示Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞和P21小鼠睾丸中Myc-Max-Mad结合位点处c-Myc相关辅激活物Pcaf的募集。（F） Gc1-Spg细胞和P21小鼠睾丸Wnt激活后，Myc-Max-Mad结合位点H3K9ac水平增加。数据绘制为平均值±SD，n个= 4. ***,P（P）≤ 0.001; **,P（P）≤ 0.01; *,P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。N.S，不显著。
图6
图6
Sin3A在Sox8指数促进剂使其保持被抑制状态。（A） ChIP显示在Myc-Max-Mad结合位点存在MaxSox8指数对照组和Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞中的启动子。（B） Gc1-Spg细胞中的ChIPZfp113型作为阳性对照，显示Sin3A在对照Gc1-Spg细胞中的占有率，但在Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞中没有。中从bp−500到−700的区域Sox8指数启动子被用作阴性对照。（C） Sin3A ChIP基于mrhl公司RNA沉默。（D） ChIP显示HDAC1存在于Myc-Max-Mad结合位点Sox8指数启动子位于对照Gc1-Spg细胞中，但不位于Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞中。数据绘制为平均值±SD，n个=4.***，P（P）≤ 0.001; **,P（P）≤ 0.01; *,P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。N.S，不显著。
图7
图7
组蛋白修饰标记和核小体动力学的变化Sox8指数启动子Wnt信号激活。（A和B）标记H3K27me3（A）的抑制水平和标记H3K 4me3（B）在Tcf4结合位点（bp−800）的激活水平以及mrhl公司RNA结合位点（bp−141）Sox8指数Gc1-Spg细胞（对照和Wnt3A条件培养基处理）和小鼠睾丸（P7和P21）中的启动子。（C） 对来自对照细胞和Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞的染色质进行不同时间间隔（50、55和60分钟）的微球菌核酸酶消化，以获得单核小体。（D） 1-kb上游核小体动力学的变化Sox8指数Wnt信号激活启动子。数字1至19表示1-kb上游中每50-bp的区间得分Sox8指数基因启动子，其中19个与TSS相邻。黑线表示Tcf4结合位点，红线表示染色质寡核苷酸亲和纯化（ChOP）读取结果。数据绘制为平均值±SD，n个= 4. ***,P（P）≤ 0.001; **,P（P）≤0.01；*，P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。N.S，不显著。
图8
图8
Sox8和Wnt信号在精原细胞减数分裂进程和承诺中的作用。（A） 重要的减数分裂前和减数分裂标记基因的1-kb上游启动子中的Sox8结合位点。（B） Sox8的RT-qPCR表达分析和Sox8沉默后的Western blotting分析(Stra8系列,长度x8和c-配套元件)和减数分裂标记(金属5和Hspa2型)Wnt信号激活以及对照组和Wnt3A条件培养基处理的Gc1-Spg细胞中的Sox8沉默。（D） Wnt3A条件培养基处理不同时间段（2、4和6天）后，小鼠精原细胞Gc1-Spg细胞整体染色质结构的变化。（E） 延长Wnt3A处理（24、48、72和96 h）后Gc1-Spg细胞的凋亡测定。体育课，R（右）-藻红蛋白。
图9
图9
精原干细胞标记物（A和B）的表达分析(磅5f1,Sox2系统、和纳克)（A）和减数分裂分化标志物(Scp3号机组,Dmc1公司,第11期、和Stra8系列)（B）在Gc1-Spg细胞中延长（24-、48-、72-和96-小时）Wnt3A处理。（C） 在Gc1 Spg细胞中延长（24、48、72和96小时）Wnt3A处理后Pou5f1和Stra8的蛋白质印迹分析。面板A和B中的显著性值代表了24小时Wnt3A处理。面板A和B中的数据绘制为平均值±SD，n个= 4. ***,P（P）≤ 0.001; **,P（P）≤0.01；*，P（P）≤0.05（双尾学生t吨测试）。
图10
图10
总结本研究结果的模型。该模型描述了Sox8指数在mrhl公司Wnt信号激活后的RNA结合位点（bp−141）与辅阻遏物的结合和TCF4结合位点β-catenin的招募有关（bp−800）。移位的辅升压因子可以用未知的（？）辅活化因子替代。组蛋白修饰的变化也显示出来（Ac，乙酰化；Me，甲基化）。Wnt激活后Sox8指数导致减数分裂承诺和分化。
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