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.2016年12月6日7:13616。
doi:10.1038/ncomms13616。

靶向Notch调节的非编码RNA TUG1治疗胶质瘤

Keisuke Katsushima先生 1, 夏目漱石 2, 大贺富美 1 2, Keiko Shinjo公司 1, 阿基拉·哈塔纳卡 1, Norihisa一村 1, 佐藤真也 三, 佐托鲁·高桥 三, 木村浩史 4, Totoki靖国 5, 柴田达弘 5 6, Mitsuru Naito公司 7, 金贤进（Hyun Jin Kim） 7, 宫田堪次郎 7 8, Kazunori Kataoka先生 7 8 9, Yutaka Kondo公司 1 10
附属公司

靶向Notch调节的非编码RNA TUG1治疗胶质瘤

Keisuke Katsushima先生等。 国家公社. .

摘要

靶向自我更新是癌症治疗中的一个重要目标，最近的研究主要关注Notch信号在维持胶质瘤干细胞（GSC）干细胞干细胞（stemness of globia stem cells，GSCs）中的作用。了解肿瘤特异性Notch调节将提高靶向此途径的特异性。在这项研究中，我们发现GSC中Notch1的激活特异性地诱导lncRNA、TUG1的表达。TUG1通过在细胞质中海绵化miR-145，并通过细胞核中的YY1-结合活性，通过组蛋白H3K27的局部特异甲基化，招募多梳来抑制分化基因，从而协同促进自我更新。此外，静脉注射靶向TUG1的反义寡核苷酸结合药物传递系统可诱导GSC分化并有效抑制体内GSC生长。我们的结果强调了Notch-lncRNA轴在调节胶质瘤细胞自我更新中的重要性，并为靶向TUG1作为消除GSC人群的特异性和有效治疗方法提供了有力的理论依据。

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数字

图1
图1。的标识图1作为GSC中的Notch下游目标。
(一)显示了GSC（1228和222）中具有Notch/RBPJκ基序的前50个通常高度表达的lncRNA。年-轴通过FPKM值（log）表示每个lncRNA的表达水平2). (b条)使用任何一种单克隆抗体后，通过微阵列技术（1228和222）对GSC的lncRNA表达进行分析-JAG1号机组，si-槽口1或Notch信号抑制剂（γ-分泌酶抑制剂、DAPT和RO4929097）治疗。维恩图描述了每种治疗所识别的下调lncRNA的数量。(c（c）,d日)上游地区Notch1的ChIP分析拖船1TSS公司。(c（c）)显示TSS周围RBPJκ基序的示意图图1开圆圈表示RBPJκ基序。(d日)经si处理的GSC中Notch1的富集-数控或si-槽口1ChIP分析检查的区域表示为5′-外侧，R1、R2和3′-外侧-内侧c（c）Notch1的富集度表示为输入DNA的百分比*P（P）<0.01. 学生的t吨-测试。(e（电子）)的表达式级别图1在用siRNA处理的GSC中，针对x-轴。与siRNA-阴性对照的相对表达水平（si-数控)显示在年-轴*P（P）<0.01. Kruskal–Wallis分析。(（f）,克)的表达式级别图1在经DAPT处理的GSC中(（f）)或RO4929097(克). 显示的数值与DMSO处理细胞的丰度有关*P（P）<0.01. Kruskal–Wallis分析。对于所有实验数据，误差线表示s.d(n个=3).
图2
图2。图1保持GSC的茎部特征。
(一)的表达式级别图1用si处理的GSC中的（左）和活细胞数（右）-数控或si-图1（si-拖船1#1和#2）。用台盼蓝染色法检测活细胞。所示值与si丰度有关-数控-处理过的细胞*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(b条)si处理的GSC中凋亡细胞的数量-数控或si-图1（si-图1#1和#2）通过7-AAD和PE Annexin V染色的FACS分析进行计数*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(c（c）,d日)的影响图1耗尽内斯汀活动。(c（c）)GSC-pE-Nes-222用硅处理-数控或si-图1（si-图1#1和#2）。的表达式级别图1相对于硅的丰度-数控-处理过的细胞（左）。相位对照和内斯汀-EGFP图像。比例尺，100 μm（右）。(d日)的强度内斯汀-EGFP（左）和活细胞数（右）与si的比较-数控对照组被量化。用台盼蓝染色法检测活细胞*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(e（电子）)的影响图1干性相关基因表达的缺失(SOX2标准,MYC公司,内斯汀和CD15型).年-axis表示与si中的相对表达水平-数控-处理过的细胞*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(（f）)两种si处理的GSC中SOX2和MYC的蛋白表达水平-数控或si-拖船1（si-图1#1和#2）。对于所有实验数据，误差线表示s.d(n个=3).
图3
图3。图1对抗miR-145并维持干细胞相关基因的表达。
(一)热图显示miRNAs在抑制图1在GSC（1228和222）中。颜色与日志中所示的表达级别相对应2-转换后的比例尺位于矩阵下方。红色和蓝色分别表示高电平和低电平。(b条)的影响图1GSC中miR-145表达缺失（1228和222）。年-轴表示miR-145的相对表达水平，与si中的表达水平相比-数控-处理过的细胞。表达水平归一化为内部RNU6B*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(c（c）)RNA-FISH分析图1经si处理的GSC中的（红色）和miR-145（绿色）-数控或si-图1细胞核用DAPI染色。比例尺，10 微米。(d日)与图1和miR-145检测在经两种si处理的GSC中的每个细胞中定量-数控或si-图1*P（P）<0.001，学生t吨-测试。(e（电子）)突变示意图(图1MUT）或删除(图1戴尔）图1. (（f）)外源性miR-145对图1,SOX2标准和MYC公司在GSC-pE-Nes-222中表达。部分图1成绩单(图1重量，图1MUT和图1DEL如所示(e（电子）)添加到经miR-145（miR-145）前体分子处理的GSC-pE-Nes-222中。内源性表达水平图1,SOX2标准和MYC公司进行了测量。数值与阴性对照miRNA前体（NC）处理细胞的丰度有关*P（P）<0.01，Kruskal–Wallis分析。(克)相位对照和内斯汀-miR-145的EGFP图像+图1重量+图1MUT或+图1DEL单元格，如所示（f）.比例尺，100 微米。(小时)的强度内斯汀-定量EGFP（左）和活细胞数（右）。用台盼蓝染色法检测活细胞*P（P）<0.01，Kruskal–Wallis检验。对于所有实验数据，误差线表示s.d(n个=3）。
图4
图4。抑制神经元分化相关基因图1-PRC2复合体。
(一)用抗BrU抗体进行RNA下拉分析。GSC的核提取物与图1RNA标记有BrU（BrU+）或无BrU-。图1-通过western blotting分析RNA结合蛋白。输入提取用作控制。(b条)经硅处理的GSC核提取物-数控或si-图1用抗YY1抗体免疫沉淀。免疫沉淀组分和裂解液等分（输入）进行免疫印迹。硅原子核提取物的一部分-数控-处理后的细胞也用RNase处理，用抗YY1抗体免疫沉淀，并用western blotting（RNase，左）进行分析。EZH2归一化为输入的相对强度值如所示(c（c）). (d日)维恩图显示了图1目标基因（630个基因）和1714个基因在其TSS周围包含YY1基序。630人中图1目标基因，525个基因包含YY1基序。(e（电子）)热图显示525的表达变化图1含有YY1基序的靶基因（如d日)抑制后图1（si-图1#1和#2）。颜色与日志中所示的表达级别相对应2-转换后的比例尺位于矩阵下方。红色和蓝色分别表示高电平和低电平。(（f）)中显示的525个基因的平均表达值(e（电子）). 误差条表示s.e.m*P（P）<0.001，学生t吨-测试。(克)K27me3在BDNF公司,NGF公司和NTF3型经si或si处理的GSC的启动子区域（左）及其mRNA表达水平（右）-数控，si-图1或si-年1K27me3富集以输入DNA的百分比表示（左）。相对于si的相对表达式级别-数控如图所示（右侧）。误差线表示s.d(n个=3). *P（P）<0.01. Kruskal–Wallis分析。(小时)经两种si处理的GSC中BDNF和NGF的蛋白表达水平-数控，si-拖船1或si-YY1年。(我)的表达式更改年1在经si处理的GSC中-年1值是相对于si丰度显示的-数控-处理过的细胞。误差条表示s.d(n个=3)*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(j个)ChIRP分析BDNF公司,NGF公司和NTF3型启动子区域。探头瞄准表皮生长因子受体作为阴性对照。GAPDH公司作为非-图1靶基因控制。丰富图1表示为输入DNA的百分比。误差线表示s.d(n个=3) *P（P）<0.01，Kruskal–Wallis分析。
图5
图5。YY1和EZH2结合区分析图1RNA。
(一)删除片段示意图图1第2外显子RNA。显示miR-145的结合位点（箭头）。(b条)BrU标记部分RNA下拉分析图1RNAs如中所示一使用抗EZH2和抗YY1抗体通过蛋白质印迹分析具有抗BrU抗体的免疫沉淀级分（上）。EGFP公司-ORF公司RNA被用作阴性对照。BrU标记RNA的凝胶电泳图像如下图所示。(c（c）)的表达式级别图1在GSC和血清分化GSC中。与GSC中的相对表达水平相比，在年-轴*P（P）<0.01，学生的t吨-测试。(d日)血清分化的GSCs转染图1外显子2 RNA或缺失片段，如(一).年-轴表示的相对表达式级别BDNF公司,NGF公司和NTF3型*P（P）<0.01，Kruskal–Wallis分析。对于所有实验数据，误差线表示s.d(n个=3）。
图6
图6。分析图1GSC茎干特征维持的转录本。
(一–c（c）)的影响图1细胞活性的过度表达(一)，凋亡(b条)茎相关基因的表达(SOX2标准,MYC公司,内斯汀和CD15型) (c（c）)经γ-分泌酶抑制剂（RO4929097）处理的GSC。表达每个基因的质粒载体图1转染外显子（分别对应于外显子1、外显子2和外显子3的1–2132、2133–2910和2911–7115核苷酸）。通过台盼蓝染色评估活细胞(一). FACS分析采用7-AAD和PE Annexin V染色计数凋亡细胞数(b条). 用qRT-PCR分析干细胞相关基因的表达水平。年-轴表示与DMSO处理细胞相比的相对表达水平(c（c）). 显示的数值与DMSO处理细胞的丰度有关*P（P）<0.01，Kruskal–Wallis分析。空白载体（pcDNA3.1）和表达荧光素酶（Luc）的质粒载体用于阴性对照，而NICD过表达（NICD）用于这些实验的阳性对照。(d、 e（电子）)的影响图1过度表达内斯汀活动。将表达指示基因的质粒载体添加到经RO4929097处理的GSC-pE-Nes-222中。相位对照和内斯汀-EGFP图像如所示(d日). 比例尺，100 微米。(e（电子）)的强度内斯汀-与DMSO对照组相比，EGFP（左）和活细胞数（右）被量化。用台盼蓝染色法检测活细胞*P（P）<0.01，Kruskal–Wallis分析。对于所有实验数据，误差条表示+s.d(n个=3）。
图7
图7。图1是GSC干细胞和致瘤性的关键介质体内.
(一)的表达式级别图1在正常大脑和GBM组织中(n个=24). 方框内的线代表中间值，方框的底部和顶部分别是第一和第三个四分位数。晶须表示数据的范围。P（P）<0.001，学生t吨-测试。(b条–e（电子）)RNA-FISH分析的表示图1和槽口1GBM组织中。(b条)GBM切片苏木精伊红（HE）染色。比例尺，100 微米。(c（c）,d日)RNA-FISH分析拖船1和槽口1肿瘤细胞周围区域c（c）（血管周围区域）和面积d日面板中（远离血管）b条细胞核用DAPI染色。比例尺，10 微米。(e（电子）)的频率图1-GBM标本中的阳性细胞。对来自多个区域的细胞计数进行平均。误差条表示s.d(（f）)将GSC-pE-Nes-222在NOD/SCID小鼠中进行颅内移植。移植30天后，CTRL键-DDS或图1-每周静脉注射DDS两次，共4周。RO4929097每周口服5次，持续4周。(克)治疗后4周肿瘤体积的量化（左）和拖船1在小鼠异种移植瘤细胞中（右）。与中的相对表达式级别CTRL键-DDS治疗的肿瘤显示在年-轴(n个=4). 误差条表示s.e.m*P（P）<0.01, **P（P）<0.001，Kruskal–Wallis分析。(小时)治疗后4周，代表性的HE染色全脑切片。肿瘤区域被红色虚线包围。比例尺，1 毫米。
图8
图8。分子效应图1小鼠异种移植模型中的抑制作用。
(一)RNA-FISH分析图1（红色）和槽口1（绿色）在肿瘤细胞中CTRL键-DDS（上部面板）和图1-DDS处理的小鼠（底部面板）。(b条)CD15（红色）和内斯汀-EGFP（绿色）输入CTRL键-DDS（上部面板）和拖船1-DDS治疗的肿瘤（底部面板）。星号表示血管CTRL键-DDS治疗小鼠。肿瘤区域被虚线包围图1-DDS处理的小鼠。比例尺，100 微米。(c（c）)miR-145的表达水平，SOX2标准,MYC公司和图1靶基因(BDNF公司,NGF公司和NTF3型)用qPCR对小鼠异种移植瘤细胞进行检测。相对表达水平与CTRL键-DDS治疗的肿瘤显示在年-轴(n个=4). 误差条表示s.e.m*P（P）<0.001，学生t吨-测试。(d日)神经生长因子免疫染色CTRL键-驾驶员侧车门开关（左）或图1-DDS在治疗后4周治疗肿瘤（右）。肿瘤区域被虚线包围图1-DDS处理的小鼠。比例尺，1 毫米。
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