Hyperoxia-Induced Proliferative Retinopathy: Early Interruption of Retinal Vascular Development with Severe and Irreversible Neurovascular Disruption

doi:10.1371/journal.pone.0166886

.2016年11月18日；11（11）：e0166886。

doi:10.1371/journal.pone.0166886。 2016年eCollection。

高氧诱导增殖性视网膜病变：视网膜血管发育早期中断伴严重不可逆神经血管中断

米歇尔·拉伊科¹, 赫尔米尼奥·J·卡多纳², 乔安·泰勒², 罗尼尔·沙阿¹, 凯瑟琳·法罗², Amani A Fawzi女士¹

附属公司

PMID： 27861592
PMCID公司：项目经理5115836
内政部： 10.1371/新闻稿.0166886

高氧诱导增殖性视网膜病变：视网膜血管发育早期中断伴严重不可逆神经血管中断

米歇尔·拉伊科等。公共科学图书馆一号. 2016.

.2016年11月18日；11（11）：e0166886。

doi:10.1371/journal.pone.0166886。 2016年eCollection。

作者

米歇尔·拉伊科¹, 赫尔米尼奥·J·卡多纳², 乔安·泰勒², 罗尼尔·沙阿¹, 凯瑟琳·法罗², 阿曼尼·A·法兹¹

附属公司

¹美国伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院眼科。
²美国伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院儿科。

PMID： 27861592
PMCID公司：项目经理5115836
内政部： 10.1371/新闻稿.0166886

摘要

支气管肺发育不良（BPD）是早产儿新生儿发病的一个主要原因，其发生是由于肺部发育受阻和出生后多次受辱所致。患有BPD的婴儿接触补充氧气也有早产儿视网膜病变的风险。因此，我们在BPD小鼠模型中研究了高氧对视网膜血管系统的影响。该模型的视网膜表型，我们称之为高氧诱导增殖性视网膜病变（HIPR），显示视网膜血管系统严重破坏，血管模式丧失，视网膜内血管生成紊乱，炎症和视网膜脱离。新生小鼠从出生后第0天（P）到第14天接受75%的氧气暴露，以建立BPD模型，然后在室内空气中恢复1天（P15）、7天（P21）或14天（P28）。我们量化了视网膜厚度、HIF-1α、NOX2和VEGF的蛋白水平，并通过免疫组织化学检查了这些蛋白的细胞位置。我们检查了视网膜血管完整性和炎症标记物，包括巨噬细胞（F4/80）和淋巴细胞（CD45R）。与对照组相比，HIPR小鼠的正常视网膜血管发育受到严重破坏，取而代之的是一片混乱的视网膜内血管生成。在所有时间点，与对照组相比，HIPR显示持续的透明体血管系统和明显较薄的中央视网膜。HIF-1α蛋白水平在P15时增加，而VEGF水平持续增加，直到P21。在P21处观察到视网膜内纤维蛋白原，随后在P28处观察到视网膜下沉积。在P21和P28处分别观察到炎症淋巴细胞和巨噬细胞。该模型表现为视网膜血管发育受阻、视网膜内血管生成炎症和视网膜脱离的严重表型。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。高氧诱导增殖性视网膜病变中的血管生成紊乱。**
（A）对照小鼠（RA）和HIPR中P14、P21和P28小鼠的代表性扁平坐骑用IB4染色（N=3-4）。比例尺，500μm。（B）左图是（A）中P21 HIPR红色方框的插图。右图是绿色方框的插图。存在持续的玻璃样血管，并附着在视网膜中周。比例尺，300μm。（C） HIPR视网膜的IB4（红色）、GFAP（绿色）和DAPI（蓝色）染色的视网膜横截面显示，靠近视网膜表面（N=3-4）有一个持续的玻璃样血管（箭头）。比例尺，50μm。RGCL，视网膜神经节细胞层。

**图2。高氧诱导增殖性视网膜病变中HIF-1α水平升高。**
（A）通过western blotting评估视网膜HIF-1α，通过密度计定量，并归一化为β-肌动蛋白。所示为代表性斑点。HIF-1α水平从P14到P15显著升高，然后通过P21降低。数据为褶皱变化±SEM（每组n≥4）。（B）视网膜横截面用HIF-1α（黑色，N=3）进行免疫染色，并用甲基绿进行复染。HIF-1α存在于视网膜神经节细胞层和内核层细胞核（星号）。比例尺，100μm。ONL，外核层。INL，内核层。RGCL，视网膜神经节细胞层。IPL，内丛状层。

**图3。在高氧诱导的增殖性视网膜病变中，VEGF定位于视网膜神经节细胞层和内网状层。**
（A）用ELISA定量视网膜蛋白VEGF水平。VEGF在P21之前升高，然后降低。数值为平均值±SEM（N=4）。#与HIPR P14相比，p<0.05 HIPR P15。*与相应年龄匹配的RA对照组相比，p＜0.05 HIPR。§与HIPR P15相比，p<0.05 HIPR P21。（B）切片用VEGF（红色）免疫染色，并用内皮细胞标记物CD31（绿色）和DAP1（蓝色，N=2）共同染色。VEGF在P15的RGCL中发现，在P21的IPL中主要发现。持续性玻璃样血管VEGF和CD31强烈染色，这些玻璃样血管靠近视网膜内侧（箭头所示）。INL，内核层。RGCL，视网膜神经节细胞层。IPL，内丛状层。比例尺，50μm。

**图4。高氧诱导增殖性视网膜病变时视网膜VEGFR2水平升高。**
免疫组织化学显示VEGFR2（红色）细胞位置。切片用GFAP（绿色）染色，以检测活化的Mϋller细胞（N=3）。在HIPR中，VEGFR2通过P21与GFAP共同定位。HIPR持续性玻璃样血管可见高强度VEGFR2染色。INL，内核层。RGCL，视网膜神经节细胞层。IPL，内丛状层。比例尺，50μm。

**图5。高氧诱导增殖性视网膜病变中NOX2表达增加。**
（A，B）通过western blotting评估视网膜NOX2，通过密度计定量，并归一化为β-actin。（A）显示了具有代表性的western blots。垂直黑线表示在同一个斑点上的这些车道之间运行了单独的样本。（B）西方人的量化显示，NOX2水平从P14显著增加到P15，从P15显著增加到P21。数据为褶皱变化±SEM（每组n≥5）。*与年龄匹配的RA对照组相比，p<0.05 HIPR。§p<0.05 HIPR P21与HIPR P15相比。（C）视网膜横截面用NOX2（绿色）、IB4（红色）进行免疫染色，用DAPI（蓝色，N=3）进行复染。在RA中，NOX2仅见于血管。在HIPR中，在视网膜神经节细胞层观察到NOX2。比例尺，50μm。INL，内核层。IPL，内丛状层。RGCL，视网膜神经节细胞层。

**图6。在高氧诱导的增殖性视网膜病变中，视神经附近和外周视网膜的视网膜变薄。**
（A） P21 RA（顶部）和HIPR（底部）的横截面显示持久性透明血管（蓝色星号）。插图（蓝色矩形）对应于（B）中放大倍数较高的图像。比例尺，500μm。五十、透镜。五、玻璃质的。（B）横截面进行H&E染色（N=3-4）。在P21和P28的HIPR中，外核层和内核不可区分，表明外丛状层严重变薄。比例尺，50μM。ONL，外核层。INL，内核层。RGCL，视网膜神经节细胞层。PR，光感受器。距视神经（C）或视网膜周边（D）100μm处的视网膜层厚度。（C）在视神经附近，与RA相比，HIPR在所有时间点的视网膜都较薄。（D）在P15、P21和P28时，外周HIPR视网膜明显比RA薄。*p<0.05 HIPR与相应年龄匹配的RA。§p<0.05 HIPR P21与HIPR P15相比。数值为平均值±SEM（N=3-4）。

**图7。高氧诱导增殖性视网膜病变中视网膜内纤维蛋白原的表达。**
（A）视网膜横截面用纤维蛋白原（绿色）、IB4（红色）进行免疫染色，用DAPI（蓝色，N=3）进行复染。RA小鼠视网膜和玻璃体未见纤维蛋白原染色。然而，纤维蛋白原染色在HIPR的内核层、内网状层（箭头所示）和神经节细胞中可见。在P21和P28的HIPR玻璃体和P28 HIPR的视网膜下间隙也观察到纤维蛋白原染色。箭头表示持续的玻璃样血管。比例尺，50μm。INL，内核层。IPL，内丛状层。RGCL，视网膜神经节细胞层。视网膜色素上皮。

**图8。高氧诱导增殖性视网膜病的内丛状层中存在白细胞。**
（A）视网膜横截面用（A）F4/80（红色）或（B）CD45（绿色）进行免疫染色，并用DAPI（蓝色，N=3）进行复染。RA中没有F4/80或CD45染色。在HIPR中，F4/80和CD45均出现在IPL的P21和P28处。比例尺，50μm。INL，内核层。IPL，内丛状层。RGCL，视网膜神经节细胞层。

**图9。高氧诱导增殖性视网膜病变中发现的胶原纤维。**
视网膜横截面用Masson三色染色（N=3）。P21和P28 HIPR视网膜中检测到胶原纤维（箭头所示）。P28 HIPR玻璃体内可见红细胞，附近有一个持久性玻璃样血管（箭头）。比例尺，100μm。RGCL，视网膜神经节细胞层。五、玻璃质的。

**图10。高氧诱导增殖性视网膜病变模型下游事件示意图。**
在P14处去除75%的氧气后，除了持续的玻璃样血管（蓝色）外，没有看到视网膜血管。到P15时，HIF-1α的激增导致中央视网膜和中周边的VEGF和血管生成（红色）增加。在P21，IPL中的血管生成紊乱（红色），VEGF和NOX2增加。在视网膜中观察到纤维蛋白原和CD45+淋巴细胞。P28显示视网膜较薄，玻璃体中检测到胶原纤维，表明牵引性视网膜脱离。在玻璃体和视网膜下间隙中发现纤维蛋白原（绿色）（提示渗出性脱离），玻璃体中出现出血（红点）。P28时CD45+淋巴细胞和F4/80+巨噬细胞增加。

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