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.2015年11月12日；6（11）：e1972。
doi:10.1038/cddis.2015.330。

自噬对人视网膜色素上皮细胞对脂褐素荧光团A2E的保护作用：年龄相关性黄斑变性的意义

J张 1 2 3, Y Bai（Y白） 1 2 3, L Huang（L黄） 1 2 3, Y Qi先生 1 2 3, Q张 1 2 3, S李 1 2 3, 吴彦祖 4, X李 1 2 3
附属公司

自噬对人视网膜色素上皮细胞对脂褐素荧光团A2E的保护作用：与年龄相关性黄斑变性的关系

J张等。 细胞死亡病. .

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人中心视力丧失的主要原因。视网膜色素上皮（RPE）细胞的退化是AMD发病和进展的关键因素。A2E是与AMD有关的毒性脂褐素的主要成分，随着年龄的增长，它会沉积在RPE细胞中。然而，A2E参与AMD发病机制的机制尚不清楚。我们证明A2E是RPE细胞的危险信号，它以浓度和时间依赖的方式诱导自噬并降低细胞活力。用25μM A2E处理RPE后15分钟内，用透射电镜检测自噬体的诱导。将RPE细胞与A2E连续孵育后，发现LC3呈强点状染色，LC3-II和Beclin-1表达增加。同时，细胞间黏附分子（ICAM）、白细胞介素（IL）1β、IL2、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、巨噬细胞阳离子肽（MCP）-1、基质细胞衍生因子（SDF）-1和血管内皮生长因子A（VEGFA）水平升高。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和激活剂雷帕霉素也用于验证自噬对RPE细胞抗A2E的作用。我们的结果表明，3-MA降低了A2E诱导的自噬体和LC3点，增加了炎症相关蛋白的表达，包括ICAM、IL1β、IL2、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22和SDF-1，并上调了VEGFA的表达。而雷帕霉素增强了A2E介导的自噬，减弱了炎症相关因子和血管生成因子的蛋白表达，并阻断了Akt/mTOR通路。总之，A2E在孵育早期诱导RPE细胞自噬，这种自噬反应可被3-MA抑制或通过mTOR途径被雷帕霉素增强。自噬增强通过减少炎性细胞因子和VEGFA的分泌，对RPE细胞对抗A2E的不利影响具有保护作用。

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数字

图1
图1
接触A2E的RPE细胞增殖减少，细胞因子表达增加。(一)A2E的结构。所示为紫外可见吸光度最大值（nm），质量荷电比(米/z)、和电子转换分配(↔). (b条−d日)细胞活力0.5、1、3、6、12、24或48 在引入浓度为10、25和50的A2E后h μM、 通过CCK-8分析进行探测。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=6. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析。A2E溶解在DMSO中，细胞在培养基中仅暴露于DMSO作为阴性对照。(e（电子）)10、25和50处理的RPE细胞的典型形态学图像 μ12、24和48的M A2E h.比例尺：100 μ米(（f）和克)采用多重细胞因子分析法测定经25 μ6人的M A2E h、 12和24 h.数据表示为平均值±S。E.M.公司。，n个=3. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001对对照，方差分析
图2
图2
A2E刺激RPE细胞自噬。(一)暴露于25 μM A2E用于15 最小值，30 最小值、1、3、6、12和24 h.自噬液泡用黑色箭头表示。比例尺：200 纳米。(b条)暴露于25 μ3、6、12和24的M A2E h、 荧光显微镜立即显示显示LC3点的RPE细胞的代表性图像。细胞核用DAPI染色。白色箭头表示LC3阳性点。比例尺：20 μ米(c（c）)每个细胞LC3阳性点的定量。数据显示为平均值±S。E.M.公司。，n个=6. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析。(d日)1、3、6、12和24时RPE细胞中Beclin-1、LC3-I和LC3-II蛋白的表达水平 引入25小时后 μM A2E通过蛋白质印迹进行定量。β-Actin被用作内部控制。(e（电子）和（f）)Beclin-1和LC3-II蛋白表达水平的量化。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=3. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析
图3
图3
3-MA抑制A2E诱导的RPE细胞自噬。(一)荧光显微镜用于检测经25 μM A2E和/或10 米米12的3-MA h.比例尺：20 μ米(b条)每个细胞LC3阳性点状细胞的定量。数据显示为平均值±S。E.M.公司。，n个=6. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析。(c（c）)Western blot分析25 μM A2E或A2E（25 μM） 与10合并 米米12的3-MA 小时(d日和e（电子）)Beclin-1和LC3-II蛋白表达水平的量化。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=3. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析
图4
图4
3-MA和A2E共同加剧了RPE细胞的死亡并刺激了细胞因子的产生。细胞暴露于25 μM A2E和/或10 米米12的3-MA 小时(一)A2E或A2E与3-MA联合处理的RPE细胞的典型TEM显微照片。比例尺：500 纳米。(b条)用CCK-8测定法测定细胞活力。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=6. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析。(c（c）和d日)采用多重细胞因子分析法检测A2E或A2E联合3-MA处理的RPE细胞中炎症因子和血管生成细胞因子的蛋白表达。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=3. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析
图5
图5
雷帕霉素增强A2E诱导的RPE细胞自噬。(一)荧光显微镜用于监测经25 μM A2E和/或100 n个米雷帕霉素12 h.比例尺：20 μ米(b条)每个细胞LC3阳性点状细胞的定量。数据显示为平均值±S。E.M.公司。，n个=6. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析。(c（c）)用western blot法测定A2E或A2E联合雷帕霉素处理的RPE细胞中mTOR和Akt的总水平，以及mTOR与Akt磷酸化水平。(d日)采用western blot检测A2E或A2E联合雷帕霉素处理的RPE细胞中Beclin-1、LC3-I和LC3-II蛋白的表达。(e（电子）−小时)p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt、Beclin-1和LC3-II蛋白表达水平的量化。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=3. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析
图6
图6
雷帕霉素使与A2E孵育的RPE细胞的细胞活力和细胞因子生成恢复到正常水平。RPE细胞用25 μM A2E和/或100 n个米雷帕霉素12片 小时(一)A2E或A2E联合雷帕霉素处理的RPE细胞的典型TEM显微照片。比例尺：500 纳米。(b条)通过CCK-8分析检测细胞活力。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=6. **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析。(c（c）和d日)通过多重细胞因子分析检测A2E或A2E联合雷帕霉素处理的RPE细胞中炎症因子和血管生成细胞因子的蛋白表达。数据以平均值±S表示。E.M.公司。，n个=3. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，方差分析
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