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。2015年10月26日5:515720。
doi:10.1038/srep15720。

噻加宾通过抑制小胶质细胞活化保护多巴胺能神经元对抗神经毒素

刘杰（音译） 1 2, 黄东平 1, 静旭 1, 嘉宾通 1, 王紫珊 1, 李黄 1, 杨玉芳 1, 白晓晨 1, 潘旺 1, 海云索 1, 马媛媛 1, 梅雨 1, 简飞 三 4, 方煌 1 5
附属机构

噻加宾通过抑制小胶质细胞活化保护多巴胺能神经元对抗神经毒素

刘杰（音译）等。 科学代表。 。

摘要

在帕金森病（PD）等神经退行性疾病中，小胶质细胞活化和炎症与进行性神经元凋亡相关。γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，最近研究表明其在免疫系统中发挥抑制作用。噻加宾是一种哌啶衍生物，通过抑制GABA转运体1（GAT1）增强GABA能量传递。在本研究中，我们发现噻加宾预处理减弱了小胶质细胞的激活，对黑质纹状体轴提供了部分保护，并改善了甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）PD小鼠模型的运动障碍。用MPTP攻击GAT 1基因敲除小鼠后，噻加宾的保护功能被取消。在另一种帕金森病模型中，通过腹腔输注脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞抑制和随后的替加宾的神经保护作用得到了证实。此外，GABA能药物预处理可抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症激活和条件培养液对SH-SY5Y细胞的毒性。核因子κB（NF-κB）核转位的减弱和炎症介质生成的抑制是其潜在机制。我们的结果表明，噻加宾对黑质纹状体小胶质细胞激活起到了刹车作用，可能是治疗PD的一种新方法。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。Tiagabine在90岁时对黑质纹状体轴几乎没有影响 MPTP给药后min。
(一个)纹状体MPP的HPLC分析+级别（n = 3). (B)纹状体多巴胺和5-羟色胺及其代谢产物水平（n = 3–4）。(C)免疫组织化学染色显示纹状体TH-ir神经纤维（比例尺：0.2 毫米）。染色相对光密度的密度分析如右侧面板所示（n = 3). (D类)免疫组织化学染色显示黑质TH-ir细胞（比例尺：0.2 毫米）。右侧面板显示TH-ir细胞的体视学计数（n = 3). (E类)Western blot显示SN.GAPDH中TH蛋白水平作为负荷控制。右侧面板显示了相对TH蛋白表达水平的量化（n = 3–4）。(F类)纹状体中Iba-1（绿色）的免疫荧光染色（比例尺：0.1 毫米）。右侧面板显示纹状体中Iba-1阳性细胞的体视学计数（n = 3). (G公司)SN中Iba-1（红色）和TH（绿色）的免疫荧光染色（比例尺：0.1 毫米）。SN中Iba-1-阳性细胞的体视学计数如右侧面板所示（n = 3). 所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。*对 < 0.05和**对 < 0.01.
图2
图2。噻加宾在服用MPTP后1天和9天改善MPTP诱导的黑质纹状体多巴胺能毒性。
从纹状体采集样本(一个,B,D类,E类)和黑质(C,F类)1天(一个–C)或9天(D类–F类)治疗后。(一个,D类)Western blot显示纹状体TH蛋白水平。β-actin作为负荷控制。下面板显示了相对TH蛋白表达水平的量化。(B,E类)免疫组织化学染色显示纹状体TH-ir神经纤维。染色相对光密度的密度分析如下部面板所示（比例尺：0.2 毫米）。(C,F类)免疫组织化学染色显示黑质TH-ir细胞。左下角显示TH-ir细胞的体视学计数，右下角显示Nissl阳性神经元的计数（比例尺：0.2 毫米）。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。*对 < 0.05和**对 < 0.01（牛顿） = 5–9）。
图3
图3。muscimol和baclofen均不影响MPTP诱导的黑质纹状体多巴胺能毒性。
从纹状体采集样本(一个,B,D类,E类)和黑质(C,F类)药物治疗后1天。(一个,D类)Western blot显示纹状体TH蛋白水平。β-actin作为负荷控制。下面板显示了相对TH蛋白表达水平的量化。(B,E类)免疫组织化学染色显示纹状体TH ir神经纤维。染色相对光密度的密度分析如下部面板所示（比例尺：0.2 毫米）。(C,F类)免疫组织化学染色显示黑质TH-ir细胞。左下角显示TH-ir细胞的体视学计数，右下角显示Nissl阳性神经元的计数（比例尺：0.2 毫米）。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。*对 < 0.05和**对 < 0.01（牛顿） = 5–8).
图4
图4。噻加宾改善MPTP引起的运动障碍。
药物治疗8天后进行旋转试验。(一个)各组小鼠在不同转速下在杆上花费的时间。(B)每组棒的总体性能得分。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。**对 < 0.01，与生理盐水治疗组相比；^P（P） < 0.05，与MPTP治疗组相比（n = 8–12).
图5
图5。WT和服务贸易总协定1注射MPTP后1天敲除小鼠。
(一个)野生型小鼠纹状体（a）中Iba-1（绿色）的免疫荧光染色和SN（b）中TH（红色）和Iba-1的双重免疫荧光染色（比例尺：0.1 毫米）。纹状体（c）和SN（d）中Iba-1阳性细胞的体视学计数如下图所示。(B)纹状体（a）中Iba-1的免疫组织化学染色和SN（b）中TH（红色）和Iba-1（绿色）的双重免疫荧光染色GAT 1型敲除小鼠（比例尺：0.1 毫米）。纹状体（c）和SN（d）中Iba-1阳性细胞的体视学计数如下图所示。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。**对 < 0.01，与生理盐水对照组相比；^对 < 0.05和^^对 < 0.01，与MPTP治疗组相比（n = 3–4).
图6
图6。麝香草酚、巴氯芬和噻加宾可改善LPS注射后4天SN小胶质细胞过度激活，并防止多巴胺能神经元丢失。
(一个)免疫组织化学染色显示黑质中的TH ir细胞（比例尺：0.2 毫米）。TH-ir细胞的体视学计数（n = 3-4）和Nissl阳性神经元（n = 3–4）在对照组的两侧，LPS和LPS+噻加宾组如右侧面板所示。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。*对 < 0.05和**对 < 0.01. (B)SN中TH（红色）和Iba-1（绿色）的免疫荧光染色（比例尺：0.1 毫米）。对照组、LPS组和LPS+替加宾组两侧Iba-1阳性细胞的立体计数如右图所示。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜**对 < 0.01（牛顿） = 3–4).
图7
图7。麝香酚、巴氯芬和GABA阻断LPS诱导的BV-2小胶质细胞活化在体外通过抑制NF-κB信号通路。
(一个,B)BV-2细胞中的亚硝酸盐分析。使用Griess试剂测定上清液中的亚硝酸盐水平。(一个)测定LPS刺激后亚硝酸盐释放的时间曲线。(B)亚硝酸盐浓度测定为24 LPS刺激后h，使用或不使用GABA、麝香草酚或巴氯芬进行预处理。(C,D类)不同浓度GABA预处理LPS刺激的BV-2细胞条件培养液的作用(C)和巴氯芬(D类)SH-SY5Y细胞活性。(E类,F类)BV-2细胞NF-κB活性的荧光素酶测定。(E类)LPS刺激后测定荧光素酶活性的时间曲线。(F类)测定相对荧光素酶强度6 LPS刺激后h，预先服用或不服用GABA、麝香草酚或巴氯芬。(G公司,H（H）)NF-κB（p65亚单位）在BV-2细胞中的核定位。用1刺激BV-2细胞 μg/ml LPS，在指定时间内使用或不使用药物进行预处理。(G公司)Western blot分析显示细胞核p65蛋白水平；层粘连蛋白B1作为负荷控制。下部面板显示了相对p65蛋白表达水平的量化。(H（H）)用抗p65抗体评估p65的亚细胞定位，用DAPI对细胞核进行复染（比例尺：10 微米）。所有数据均表示为平均值 ± 扫描电镜。*对 < 0.05和**对 < 0.01，与生理盐水对照组相比^对 < 0.05和^^对 < 0.01，与LPS治疗组相比（n = 3).
图8
图8。噻加宾在MPTP和LPS诱导的PD模型中的神经保护机制图。
在左侧面板中，MPP+（MPTP的有毒代谢物）导致纹状体TH活性和TH立即受损+纤维和纹状体小胶质细胞的活化。TH的损坏+随后观察SN中的神经元和小胶质细胞激活。噻加宾抑制小胶质细胞激活，从而保护多巴胺能神经元。在右侧面板中，LPS直接刺激小胶质细胞并诱导炎症反应。噻加宾抑制这一过程，从而保护多巴胺能神经元的丢失。
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