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.2015年9月15日；128(18):3398-410.
doi:10.1242/jcs.168583。 Epub 2015年8月13日。

编码Sec61β（一种尾锚定蛋白）的mRNA定位于内质网

崔贤英 1, 张慧（音） 1, 莉娜·伊兰 1, 刘爱欣 1, 艾丽娜·哈楚克 1, 亚历山大F宫 2
附属公司

编码Sec61β（一种尾锚定蛋白）的mRNA定位于内质网

仙英阿翠等。 细胞科学杂志. .

摘要

虽然尾锚定蛋白翻译后靶向内质网（ER）的一条途径已经明确，但尚不清楚是否存在其他途径。在此，我们提供证据表明，编码尾锚定蛋白（包括Sec61β和nesprin-2）的mRNA子集部分定位于哺乳动物细胞内质网表面。特别是，Sec61b mRNA可以通过翻译依赖性和独立性机制靶向内质网，并随后维持在内质网上。我们的数据表明，这一过程独立于p180（也称为RRBP1）、ER上已知的mRNA受体、跨膜域识别复合物（TRC）通路成分、TRC40（也称为ASNA1）和BAT3（也称为BAG6）。此外，我们的数据表明，Sec61b mRNA可能访问反式结合核糖体。我们的研究结果表明，某些尾锚定蛋白可能直接在内质网上合成，这有助于它们的膜插入。因此，很明显，哺乳动物细胞利用多种机制确保尾锚定蛋白有效靶向内质网表面。

关键词：内质网；分泌；尾锚定蛋白；mRNA定位。

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作者声明没有竞争或财务利益。

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图1。
图1。
内源性的第61b节并且nesprin-2mRNA与ER膜结合。U2OS细胞：固定（未提取）；首先用洋地黄素提取，然后固定（提取）；或用嘌呤霉素（Puro）或高三尖杉酯碱（HHT）预处理30 min，在有或无EDTA的情况下用洋地黄提取，然后固定。用一池FISH探针对细胞进行染色，以观察单个内源性人类第61b节，nesprin-2或GAPDH公司mRNA分子。通过相位显微镜观察每个细胞，以确定细胞轮廓。使用NIS-element“斑点检测”功能确定mRNA病灶（见材料和方法部分）。（A） mRNA FISH信号与细胞和细胞核的轮廓重叠，并通过斑点检测功能突出检测到的病灶。（B） 确定每种情况下的细胞质（即非核）病灶数量。每个条形图是30个单元格的平均值±标准偏差。比例尺：20 微米。
图2。
图2。
过度表达GFP-第61b节mRNA与ER膜相关。（A） 结构示意图。全部时间-平方英尺序列以白色显示，第61b节序列以灰色显示EGFP公司序列显示为阴影框。（B，C）嵌合体质粒，包含第61b节5′UTR、3′UTR或ORF融合到t-ftz（t-ftz）转染COS7细胞。18-24岁 转染后h，用对照或HHT处理细胞，然后提取洋地黄素以去除细胞质内容物。用FISH探针对细胞进行固定和染色自由贸易区、和图像。（D–F）质粒编码GFP–第61b节或H1B–绿色食品转染U2OS细胞。18-24岁 转染后h，细胞要么直接固定（未提取），要么提取洋地黄素（提取）。GFP–第61b节或H1B–绿色食品用FISH探针对mRNA进行染色GFP公司-编码顺序和可视化。未提取和提取洋地黄素细胞中的mRNA如D所示。注意GFP–第61b节，但不是H1B–绿色食品mRNA对洋地黄素提取有抵抗力，呈现网状染色模式。（E） GFP–Sec61β蛋白和mRNA在洋地黄素提取的U2OS细胞中的分布。这两幅图像都来自同一个视场。注意mRNA与其编码蛋白的广泛共定位，其定位于ER（Rolls等人，1999；Shibata等人，2008）。（F） 量化GFP–第61b节和H1B–绿色食品mRNA细胞质强度信号。测定提取细胞与未提取细胞细胞质中的荧光比率。C和F中的每一条代表三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验至少包含30个细胞。比例尺：20 微米。
图3。
图3。
过表达的ER关联GFP–第61b节mRNA部分独立于翻译。用质粒编码法转染（A，B）COS7和U2OS（C，D）细胞GFP–第61b节并允许表达18-24的mRNA h.然后用二甲基亚砜（Ctrl）、嘌呤霉素（Puro）或高三尖杉酯碱（HHT）处理细胞30 分钟，然后用含有或不含有EDTA的洋地黄素提取。然后固定细胞，并使用针对GFP编码序列的特定FISH探针对mRNA进行染色。细胞成像（A，D），荧光强度定量（B，C）。为了控制染色的变化，还分析了核荧光强度。每个条形代表三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验至少包含30个细胞。（E） U2OS细胞表达GFP–第61b节用HHT处理，然后提取洋地黄素。然后对细胞进行染色GFP–第61b节mRNA，并用ER标记Trapα进行免疫染色。E中的图像来自单个视野，包括显示GFP–第61b节红色为mRNA，绿色为Trapα。比例尺：20 微米。
图4。
图4。
编码潜力GFP-第61b节不需要将其本地化到ER。（A） 用编码各种GFP标记的尾锚定蛋白的质粒转染COS7细胞，并允许其在18-24周内表达 h.用对照培养基或HHT处理细胞30 min，然后直接固定或用洋地黄素提取，然后固定。使用针对GFP编码序列的特异性FISH探针对细胞进行mRNAs染色，然后对其进行成像和定量。细胞质和细胞核的荧光强度被量化。所有结果均归一化为未提取细胞的细胞质染色强度。每个条形代表三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验至少包含30个细胞。（B） 疏水性(年-轴，左）编码的多肽GFP–第61b节和GFP-fs-Sec61b根据肽长度绘制(x个-轴，底部）。Kyte–使用ProtScale计算Doolittle水疗值(http://web.expasy.org/portscale/)，使用21个氨基酸的移动窗口。注意GFP–Sec61β的TMD区域的高疏水性，该区域在GFP–fs-Sec61β中丢失。（C） 用质粒编码转染COS7细胞GFP–fs-Sec61b并允许表达18-24的mRNA h.然后用对照培养基或HHT处理细胞30 min，然后固定（未提取）或用洋地黄素提取，然后固定。使用针对GFP编码序列的特定FISH探针对细胞进行mRNA染色，并使用DAPI对细胞进行DNA染色。每行代表为其成像的单个视场GFP–fs-Sec61bmRNA、GFP蛋白和DAPI。（D） 细胞质（未提取细胞）、ER（提取细胞）和核荧光强度的定量GFP–fs-Sec61bmRNA。每个条形代表30个单元格的平均值±标准偏差。比例尺：20 微米。
图5。
图5。
初始目标第61b节内质网的mRNA部分依赖于核糖体和翻译。用对照培养基（Ctrl）或HHT预处理U2OS细胞15 min，然后微量注射含有GFP–第61b节并允许表达2 h，在含有或不含HHT的介质中。然后用洋地黄素提取细胞，固定并用FISH探针对GFP编码序列进行染色，然后成像。（A） 代表性图像，每一行代表一个为GFP–第61b节mRNA（mRNA）和GFP荧光（GFP）。（B） 定量提取细胞内质网和细胞核中mRNA的荧光强度。每个条形代表三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验至少包含30个细胞。比例尺：20 微米。
图6。
图6。
以下ER关联不需要p180、TRC40和BAT3第61b节mRNA和蛋白质。（A–C）U2OS细胞感染了携带控制shRNA的慢病毒（Lenti）或针对p180（克隆B9或B10）、TRC40（克隆A或B）或BAT3（克隆E）的shRNA。对照细胞和shRNA感染细胞转染含有ALPP公司或GFP–第61b节构建并允许表达18-24个mRNA h.然后用对照培养基或HHT处理细胞30 min，提取洋地黄素，固定并用特定的FISH探针染色，然后成像。（A） 转染当天收集细胞裂解液，用SDS-PAGE分离，并对p180、TRC40、BAT3和α微管蛋白进行免疫印迹。（B，C）荧光强度的量化ALPP公司（B） 和GFP–第61b节（C） 内质网和细胞核中的mRNA。将结果归一化为感染对照shRNA并用对照培养基处理的细胞的ER染色强度。每个条形代表三个或四个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验至少包含30个细胞*P（P）<0.05（学生未配对t吨-测试）。（D） shRNA感染的U2OS细胞转染含有GFP–第61b节并允许表达18-24的mRNA h.然后用或HHT处理细胞30 分钟。提取洋地黄素，固定并染色细胞GFP–第61b节mRNA使用FISH探针对抗GFP编码区。每一列代表GFP蛋白和GFP mRNA成像的单个细胞场。（E，F）shRNA感染的U2OS细胞用含有GFP–第61b节并允许表达18-24的mRNA h.直接裂解细胞（E）或将其分为胞质（Cyto）和内质网（ER）组分（F）。使用抗GFP抗体（GFP–Sec61β）、内源性Sec61β、Trapα（ER标记）和GAPDH（细胞溶质标记）通过免疫印迹分析总裂解物（E）和分馏样品（F）。单独或同时耗尽p180或TRC40均不会影响GFP–Sec61β或内源性Sec61β蛋白的水平或ER定位。（G） 用FISH探针池对提取或直接固定的shRNA-infected U2OS细胞进行染色，以观察单个内源性人类第61b节mRNA。计算提取的洋地黄素与未提取的细胞中残留的细胞质病灶的百分比。定量结果表示30个未提取细胞和30个提取细胞的平均值±标准偏差。比例尺：20 微米。
图7。
图7。
以下ER关联不需要BAT3第61b节mRNA和蛋白质。（A） 对照组和BAT3中BAT3蛋白的Western blot−/−MEF公司。（B、C）电池3−/−MEF表示GFP–第61b节18-24岁 h被固定，并对ER标记Trapα进行免疫染色。B中的图像来自单个视野，包括显示GFP–第61b节绿色为mRNA，红色为Trapα。C（D，E）BAT3显示了B中方框区域的高倍图像−/−MEF表示GFP–第61b节18–24岁 提取h并对其进行染色GFP公司mRNA经FISH和ER标记Trapα免疫染色。（D） 单个视野显示GFP公司mRNA、GFP蛋白、Trapα和GFP公司mRNA（红色）和Trapα（绿色）。方框区域的高倍图像如E所示，覆盖有GFP–第61b节mRNA（红色）、GFP–Sec61β蛋白（绿色）和Trapα（蓝色）。（F） BAT3电池−/−MEF要么直接固定（未提取），首先用洋地黄素提取，然后固定（提取），要么用高三尖杉酯碱（HHT）预处理30 min，用洋地黄素提取，然后固定。用一池FISH探针对细胞进行染色，以观察单个内源性小鼠第61b节mRNA分子。（G） 在对照MEF和BAT3中，测定了每种情况下的细胞质（即非核）病灶数量−/−细胞。每个条形图是30个单元格的平均值±标准偏差。比例尺：20 微米。
图8。
图8。
GFP–第61b节mRNA与t-ftz（t-ftz）内质网核糖体结合位点的mRNA。用含有测试基因的质粒转染（A，B）COS7细胞(t-ftz（t-ftz）或ALPP公司)单独或与含有竞争基因的质粒结合(GFP–第61b节或H1B–绿色食品). 然后用对照培养基（Ctrl）或HHT处理细胞30 min，然后提取洋地黄素，固定并用特定的FISH探针染色，然后成像。（A） COS7细胞表达的代表性图像t-ftz（t-ftz）单独使用信使核糖核酸（a–c）或与GFP–第61b节（d–i）或H1B-–绿色食品（j–o）。面板a–c被染色t-ftz（t-ftz）mRNA，而d–o中的每一对面板代表为时间-平方英尺mRNA和GFP荧光。（B） 内质网和核染色强度的量化t-ftz（t-ftz）mRNA或ALPP公司转染细胞中的mRNA。所有数据均按照对照治疗组每个构造的ER染色强度进行标准化。每个条形代表三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验至少包含30个细胞。（C） COS7细胞转染t-ftz（t-ftz）单独或结合GFP–fs-Sec61b18–24岁 转染h后，提取细胞洋地黄素去除细胞质内容物。GFP–fs-Sec61b用FISH探针对mRNA进行染色GFP公司-编码顺序和可视化。（D） 共转染COS7细胞的细胞裂解物t-ftz（t-ftz）结合H1B–GFP或GFP–fs-Sec61β进行蛋白质印迹分析。使用针对t-ftz蛋白中HA表位的HA抗体和针对α-微管蛋白的抗体检测t-ftz蛋白质的表达，以控制负载。比例尺：20 微米。
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