Attenuation of microglial activation in a mouse model of Alzheimer's disease via NFAT inhibition

doi:10.1186/s12974-015-0255-2

.2015年3月4日12时42分。

doi:10.1186/s12974-015-0255-2。

通过NFAT抑制阿尔茨海默病小鼠模型中小胶质细胞活化的减弱

拉里达·罗亚纳塔曼尼^1 2, 安吉拉·弗洛登^三, Gunjan D Manocha公司⁴, 科林·K·库姆斯⁵

附属公司

¹苏拉纳雷理工大学科学研究所，地址：泰国，30000，Nakhon Ratchasima，苏拉纳雷街道大学大道111号。lalida.rojanathammanee@gmail.com。
²北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。lalida.rojanathammanee@gmail.com。
^三北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。angela.floden@med.und.edu。
⁴北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。gunjan.dhawan@med.und.edu。
⁵北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。colin.combs@med.und.edu。

PMID： 25889879
预防性维修识别码： PMC4355356型
内政部： 10.1186/s12974-015-0255-2

NFAT抑制抑制阿尔茨海默病小鼠模型中小胶质细胞活化

拉里达·罗亚纳塔曼尼等。 J神经炎症. 2015.

.2015年3月4日12时42分。

doi:10.1186/s12974-015-0255-2。

作者

拉里达·罗亚纳塔曼尼^1 2, 安吉拉·弗洛登^三, Gunjan D Manocha公司⁴, 科林·K·库姆斯⁵

附属公司

¹苏拉纳雷理工大学科学研究所，地址：泰国，30000，Nakhon Ratchasima，苏拉纳雷街道大学大道111号。lalida.rojanathammanee@gmail.com。
²北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。lalida.rojanathammanee@gmail.com。
^三北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。angela.floden@med.und.edu。
⁴北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。gunjan.dhawan@med.und.edu。
⁵北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系，地址：504 Hamline Street，Neuroscience Building，Grand Forks，ND，58203，USA。colin.combs@med.und.edu。

PMID： 25889879
预防性维修识别码： PMC4355356型
内政部： 10.1186/s12974-015-0255-2

摘要

背景：淀粉样β（Aβ）肽被假设可以刺激阿尔茨海默病（AD）大脑中的小胶质细胞获得其特有的促炎表型。Aβ导致小胶质细胞活化的具体机制仍然是确定有吸引力的干预分子靶点的一个有趣领域。基于小胶质细胞表达促炎转录因子、活化T细胞核因子（NFAT）这一事实，我们假设NFAT活性是疾病期间发生的Aβ刺激的小胶质细胞增生所必需的。

方法：在不存在或存在NFAT抑制剂、FK506和tat-VIVIT肽的情况下，用Aβ刺激原代小鼠小胶质细胞培养物，以量化细胞因子、神经毒素或Aβ吞噬作用的分泌。通过带有FK506或tat-VIVIT的微型渗透泵对AD转基因小鼠模型APP/PS1进行皮下注射，以量化对细胞因子、微胶质增生、斑块负荷和记忆的影响。

结果：通过蛋白质印迹分析验证了各种NFAT亚型在原代小鼠小胶质细胞中的表达。在没有或存在NFAT抑制剂FK506和tat-VIVIT的情况下，用Aβ纤维刺激小胶质细胞培养，以证明NFAT活性调节Aβ吞噬作用、神经毒素分泌和细胞因子分泌。将FK506和tat-VIVIT传递给转基因APP/PS1小鼠可降低脾脏而非脑细胞因子水平。然而，与对照组相比，FK506和tat-VIVIT显著减轻了治疗组小鼠的微胶质增生和Aβ斑块负荷。令人惊讶的是，这与通过T-迷宫测试的记忆性能变化无关。

结论：我们的研究结果表明，开发特异性NFAT抑制剂可能是缓解AD中微胶质增生和Aβ斑块沉积的有效策略。

PubMed免责声明

数字

图1
**小胶质细胞表达多种NFAT亚型。**小胶质细胞作为出生后第0天C57BL6/J小鼠的混合胶质细胞培养物生长，并在第14天纯化*在体外*通过使用抗NFATc1、c2、c3、c4、α-微管蛋白和ERK-2（负载对照）抗体的蛋白质印迹，将小胶质细胞（M）的裂解物与来自Jurkat人T细胞系（J）的裂解物进行比较。每个NFAT亚型的多条带可能反映了每个亚型报告的多个替代转录物。印迹是三个独立实验的代表。

图2
**FK506和tat-VIVIT可减弱小胶质细胞分泌Aβ刺激的TNFα。**在没有或存在1μM FK506或10μM tat-VIVIT的情况下，用10μM Aβ1-42纤维刺激小胶质细胞24小时。**（A）**取培养基等分样品，进行ELISA以定量分泌的TNFα水平。**（B）**还取培养基进行LDH释放分析，以量化细胞死亡。条件重复8次并取平均值（±SD）。图表代表了三个独立的实验(*第页 < 0.001）。

图3
**FK506刺激Aβ原纤维的小胶质细胞摄取增加。**在没有或存在1μM FK506的情况下，将小胶质细胞电镀24小时。将500 nM FITC-共轭Aβ1-42原纤维或0.25 mg/mL FITC-偶联生物微粒添加到细胞中，再持续6 h。孵育后，去除培养基，用台盼蓝淬灭来自非吞噬细胞肽的信号。使用荧光板阅读器定量吞噬肽和生物颗粒的荧光强度（480-nm激发和520-nm发射），并平均（±SD）。每个条件重复八次，图表代表三个独立实验（±SD）(*第页 < 0.001来自对照，^# 第页 < 0.05来自Aβ，^% 第页 < 0.001来自生物粒子）。

图4
**FK506阻止Aβ刺激后神经毒性条件培养基的小胶质细胞生成。**在没有或存在表面结合的Aβ1-42纤维（48μmole/mm）的情况下刺激小胶质细胞48小时²)以及0.1和1μM FK506。将来自单独结合Aβ孔（阴性对照）、仅小胶质细胞孔（小胶质细胞CM）和Aβ刺激的小胶质细胞孔+/-FK506的条件培养基转移至7天*在体外*小鼠皮层神经元原代培养72h。此外，将FK506（0.1和1μM）直接添加到神经元（阴性对照）和神经元以及Aβ刺激的小胶质细胞。将神经元固定并用抗MAP2抗体染色，对存活细胞进行计数和平均（±SD）。刺激重复进行三次。结果是三个独立实验的平均值(*第页 < 0.001）。

图5
**FK506和tat-VIVIT降低APP/PS1小鼠的CD68免疫反应性。**12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、切片并使用抗CD68抗体对大脑进行染色，并从海马的连续切片中量化染色强度。获得每个条件（五个条件）、每个大脑（每个条件六到八个大脑）和每个截面（每个大脑三个截面）的光密度值，求平均值（±SD），并绘制(***第页 < 0.001).

图6
**FK506和VIVIT降低了APP/PS1小鼠的Aβ斑块负荷。**12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照杂化肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、切片并使用抗Aβ（4G8）抗体对大脑进行染色，并从海马的连续切片中量化染色强度。获得每个条件（五个条件）、每个大脑（每个条件六到八个大脑）和每个截面（每个大脑三个截面）的光密度值，求平均值（±SD），并绘制(***第页 < 0.001).

图7
**FK506和tat-VIVIT降低APP/PS1小鼠的脾细胞因子水平。**12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、裂解脾脏并用于TNFα、IL-1β和IL-6 ELISA。(*第页 < 0.05, **第页 < 对照组0.01；^$ 第页 < 0.01,^$$ 第页 < 0.01来自车辆+第页 < 来自VIVIT的0.05&&第页 < 0.01来自FK506）

图8
**FK506和tat-VIVIT对APP/PS1小鼠的脑细胞因子水平没有影响。**12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、裂解海马并用于TNFα和IL-6 ELISA。

图9
**FK506和tat-VIVIT没有改善APP/PS1小鼠的空间记忆。**12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下递送治疗28天，不进行治疗（对照）、载体DMSO、1mg/kg/天FK506、0.5mg/kg/天VIVIT或0.5mg/kg/天阴性对照扰乱肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。小鼠在第28天进行T迷宫测试。对自发交替次数进行平均并绘制图表（±SD）。

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1. Dickson DW、Farlo J、Davies P、Crystal H、Fuld P、Yen SH。阿尔茨海默病。老年斑块的双标记免疫组织化学研究。美国病理学杂志。1988;132（1）：86–101。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Itagaki S、McGeer PL、Akiyama H、Zhu S、Selkoe D。小胶质细胞和星形胶质细胞与阿尔茨海默病淀粉样沉积的关系。神经免疫杂志。1989;24（3）：173–82。doi:10.1016/0165-5728（89）90115-X。-内政部-公共医学
1. Miyazono M、Iwaki T、Kitamoto T、Kaneko Y、Doh-ura K、Tateishi J。库鲁菌斑和老年菌斑的比较免疫组织化学研究，特别是淀粉样菌斑形成不同阶段的胶质反应。美国病理学杂志。1991;139(3):589–98.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Perlmutter LS、Barron E、Chui HC。阿尔茨海默病中小胶质细胞和老年斑块淀粉样蛋白之间的形态学联系。神经科学快报。1990;119(1):32–6. doi:10.1016/0304-3940（90）90748-X。-内政部-公共医学
1. Araujo DM，科特曼CW。β-淀粉样蛋白在体外刺激胶质细胞产生生长因子，这些生长因子积聚在阿尔茨海默病的老年斑块中。《大脑研究》1992；569（1）:141–5。doi:10.1016/0006-8993（92）90380-R。-内政部-公共医学

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[1] Dickson DW、Farlo J、Davies P、Crystal H、Fuld P、Yen SH。阿尔茨海默病。老年斑块的双标记免疫组织化学研究。美国病理学杂志。1988;132（1）：86–101。-项目管理咨询公司-公共医学

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