通过NFAT抑制阿尔茨海默病小鼠模型中小胶质细胞活化的减弱
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拉里达·罗亚纳塔曼尼
苏拉纳雷理工大学科学研究所，地址：泰国，30000，Nakhon Ratchasima，苏拉纳雷街道大学大道111号
美国ND 58203，Grand Forks，Neuroscience Building，504 Hamline Street，北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系
安吉拉·弗洛登
美国ND 58203，Grand Forks，Neuroscience Building，504 Hamline Street，北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系
Gunjan D Manocha公司
美国ND 58203，Grand Forks，Neuroscience Building，504 Hamline Street，北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系
科林·K·库姆斯
美国ND 58203，Grand Forks，Neuroscience Building，504 Hamline Street，北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系
苏拉纳雷理工大学科学研究所，地址：泰国，30000，Nakhon Ratchasima，苏拉纳雷街道大学大道111号
美国ND 58203，Grand Forks，Neuroscience Building，504 Hamline Street，北达科他大学医学与健康科学学院基础科学系
通讯作者。 2014年11月3日收到；2015年1月25日接受。
版权©Rojanathammene等人。；被许可方BioMed Central。2015 摘要
背景
淀粉样β（Aβ）肽被假设可以刺激阿尔茨海默病（AD）大脑中的小胶质细胞获得其特有的促炎表型。Aβ导致小胶质细胞活化的具体机制仍然是确定有吸引力的干预分子靶点的一个感兴趣的领域。基于小胶质细胞表达促炎转录因子，即活化T细胞的核因子（NFAT）的事实，我们假设NFAT活性是在疾病期间发生的Aβ刺激的小胶质细胞增生所必需的。
方法
在不存在或存在NFAT抑制剂、FK506和tat-VIVIT肽的情况下，用Aβ刺激原代小鼠小胶质细胞培养物，以量化细胞因子、神经毒素或Aβ吞噬作用的分泌。通过带有FK506或tat-VIVIT的微型渗透泵对AD转基因小鼠模型APP/PS1进行皮下注射，以量化对细胞因子、微胶质增生、斑块负荷和记忆的影响。
结果
通过Western blot分析验证了各种NFAT亚型在原代小鼠小胶质细胞中的表达。在没有或存在NFAT抑制剂FK506和tat-VIVIT的情况下，用Aβ纤维刺激小胶质细胞培养，以证明NFAT活性调节Aβ吞噬作用、神经毒素分泌和细胞因子分泌。将FK506和tat-VIVIT传递给转基因APP/PS1小鼠可降低脾脏而非脑细胞因子水平。然而，与对照组相比，FK506和tat-VIVIT显著减轻了治疗组小鼠的微胶质增生和Aβ斑块负荷。令人惊讶的是，通过T迷宫测试，这与记忆性能的变化并不相关。
结论
我们的研究结果表明，开发特异性NFAT抑制剂可能是缓解AD中微胶质增生和Aβ斑块沉积的有效策略。
电子辅助材料
本文的在线版本（doi:10.1186/s12974-015-0255-2）包含对授权用户可用的补充材料。
关键词：阿尔茨海默病、NFAT、淀粉样蛋白、小胶质细胞
背景
阿尔茨海默病的特征是存在与淀粉样β（Aβ）肽相关的反应性小胶质细胞斑块[1-4]。由于Aβ低聚物和纤维可以作为小胶质细胞活化的配体，因此通常假设它们在疾病期间参与小胶质细胞的促炎表型[5-21]。此外，Aβ肽具有刺激神经元和胶质细胞内失调的细胞内钙稳态的特性，这可能导致钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶的激活[13,22-34]。钙调神经磷酸酶活性的变化通过多种机制与阿尔茨海默病（AD）有关，包括海马的高表达和活性、钙调神经蛋白介导的突触丢失、神经元死亡、认知受损、aβ生成和星形胶质细胞激活[22,23,35-42].
钙调神经磷酸酶最丰富、研究最深入的底物之一是转录因子，即活化T细胞的核因子NFAT。虽然其生物学在免疫系统中的描述更为经典[43]NFAT的许多亚型在大脑中表达[44-48]。为了激活NFAT，NFAT被钙调神经磷酸酶去磷酸化，转移到细胞核，导致免疫细胞行为改变，细胞因子表达与许多其他转录因子一起工作，包括AP-1和NFκB[43,49-59]。在AD患者的大脑中，NFAT的各种亚型显示出不同的活化特征，轻度认知障碍（MCI）患者的NFAT1核分数（也称为NFATc2）升高，而AD患者的脑中NFAT3核分数（NFATc4）升高[38]。此外，细胞因子、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白细胞介素-1β（IL-1β）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）水平的升高与MCI和AD组织中NFAT1的核分数呈正相关，因此，NFAT1在AD相关认知能力下降早期的神经炎症中的作用[38]。NFAT3也被证明参与神经退行性过程，如神经元细胞死亡[46,60]。总的来说，这些报告表明，涉及aβ刺激或钙调节异常介导的钙调神经磷酸酶/NFAT激活和随后的神经元或胶质细胞变化的一系列事件代表了AD治疗靶向性的一条有吸引力的反应途径。
因为已经做了大量工作来定义星形胶质细胞[38,42,47,48,61-66]和神经元[22,23,41,44-46,67]NFAT在调节大脑中的促炎症、神经退行性、凋亡、萌芽或生存反应方面发挥作用，我们选择检测脑内免疫细胞（小胶质细胞）中的NFAT生物学。很明显，小胶质细胞表达NFAT亚型[65,68-72]NFATc2水平特别高[70,71]。此外，小胶质细胞的刺激增加了NFAT活性和炎症前改变，使用VIVIT肽等NFAT抑制剂可以减弱这些变化[38,42,48,63,70,73-77]。基于我们之前的工作，证明NFAT在调节小胶质细胞对aβ刺激的反应中的作用[71]在本研究中，我们继续使用这两种方法来定义小胶质NFAT对AD炎症变化的作用在体外小胶质细胞培养以及APP/PS1转基因小鼠疾病模型。我们使用了两种不同的NFAT激活抑制剂，即临床上可用的小分子FK506[78,79]和细胞渗透剂tat-VIVIT肽[70]，了解NFAT抑制对小胶质细胞表型的影响。
方法
抗体和试剂
抗-NFATc1（NFAT2）、抗-NFATc4（NFAT3）、抗NFAT3（NFAT4）、抗磷酸NFAT2（NFAT1）、抗ERK2和α-微管蛋白抗体购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。抗MAP2抗体来自Cell Signaling Technology Inc（Danvers，MA，USA）。HRP缀合的第二抗体也从Santa Cruz Biotechnology（达拉斯，德克萨斯州，美国）获得。抗NFATc2（NFAT1）抗体和FK506来自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）。抗CD68抗体来自AbD Serotec（美国北卡罗来纳州罗利市）。抗-APP抗体来自Zymed Laboratories（美国加利福尼亚州旧金山）。Elite Vectastain ABC Avidin和Biotin、Vector VIP、生物素化抗鼠抗体和抗鼠抗体来自Vector Laboratories Inc（加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）。突触体素抗体购自Chemicon International，Inc（Temecula，CA，USA）。磷蛋白-NFκB（p65）抗体、NFκB的抗体、PSD95抗体和β位点APP裂解酶（BACE）抗体均来自Cell Signaling Technology Inc（美国马萨诸塞州丹佛市）。抗Aβ（4G8）抗体来自Covance（美国加利福尼亚州埃默里维尔）。c-Fos抗体购自Novus Biologicals，LLC（美国科罗拉多州利特尔顿）。脂多糖（LPS）和MTT购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。人类Aβ1-42购自Bachem（美国加利福尼亚州托伦斯），并在使用前根据我们之前的方案进行纤维化[80]。VIVIT肽序列MAGPHPVIVITGPHEE在其钙调神经磷酸酶结合位点与NFAT相互作用并抑制其激活，与阴性对照物VEET、肽一起使用[73]。与HIV-1 tat蛋白阳离子转导域融合的VIVIT肽tat-VIVIT的细胞可渗透变体[76,77]，用于检测这种新型肽结构对NFAT抑制的潜力，如我们之前的工作中所述[70]。抑制肽tat-VIVIT（H-YGRKKRRQRR-AA-MAGPHPVIVITGPHEE-NH2)和阴性对照肽tat-VEET（H-YGRKKRRQRR-AA-MAGPPHIVEETGPHVI-NH2)由克利夫兰临床基金会（俄亥俄州克利夫兰）分子生物技术核心实验室的Satya Yadav博士合成。细胞因子酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒用于TNFα、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β，购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。异硫氰酸荧光素（FITC）生物颗粒购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。
动物
所有动物的使用都得到了北达科他大学动物护理和使用委员会（UND IACUC）的批准。本研究使用了Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）转基因小鼠系005864 B6.Cg-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J及其野生型同窝对照。向老鼠提供食物和水随意并置于12小时光照：暗循环中。该调查符合国家科学院国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》（第八版）。这些APP/PS1转基因小鼠表达人类应用程序瑞典突变K595N/M596L的Aβ前体蛋白（A4）和人类PSEN1公司在小鼠朊病毒启动子的控制下，早老素1具有DeltaE9突变。
细胞培养
原发性小胶质细胞如前所述[8]，从出生后第1天到第3天野生型C57BL/6野生型小鼠的大脑。简单地说，在小胶质细胞培养基（含有L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和20%热灭活的FBS）中去除无脑膜皮质，进行胰蛋白酶消化和研磨，并放置在T-75烧瓶中。24小时后完全替换烧瓶中的培养基，7天后部分替换为新鲜培养基。在第14天采集、计数和使用细胞在体外.
从野生型胚胎第16天（E16）小鼠（C57BL/6）的皮层培养神经元。分离、胰蛋白酶化无脑膜皮质，并将其置于含有含有L-谷氨酰胺和B27补充剂的神经基底细胞培养基的聚L-赖氨酸涂层组织培养孔上（Invitrogen，Rockville，MD，USA）。允许神经元在培养基中生长7天在体外以提供>95%的纯度。
Jurkat细胞从美国典型培养物保藏中心（ATCC，Manassas，VA，USA）获得，并保存在含有10%热灭活胎牛血清（US Biotechnologies Inc.，Parkerford，PA，USA）、5mM HEPES和1.5μg/mL抗生素（青霉素/链霉素/新霉素）的RPMI-1640培养基（Gibco RBL，Rockville，MD，USA）中。
细胞刺激
为了测定促炎细胞因子的水平，用FK506或tat-VIVIT预处理细胞30分钟，然后刺激10μM Aβ1-42 24小时。收集培养基进行ELISA。
为了了解NFAT抑制对神经元细胞活力的影响，7天在体外如前所述，初级神经元在小胶质细胞条件培养基中培养72h[25]。简单地说，96个细胞培养板上涂有Aβ1-42原纤维（48 pmole/mm2)在含有B27补充剂的无血清神经基础培养基中是否含有0.1μM FK506和1μM FK506。将小胶质细胞置于表面结合的Aβ原纤维上48小时。刺激后，将来自仅含Aβ（阴性对照）、仅含小胶质细胞的培养基以及来自受Aβ刺激的小胶质细胞培养基的条件培养基转移至神经元72小时。神经元也未经治疗，或在神经元中加入0.1μM FK506或1μM FK506以及条件培养基。所有处理后，用4%多聚甲醛固定神经元，并用抗MAP2抗体进行免疫染色。与我们之前的工作一样[25]对MAP2免疫染色阳性的存活细胞进行计数、平均和标绘（±SD）。刺激分两次进行，重复三次。在井上放置一个计数网格，以计算每种情况下八个相同区域的神经元数量。
酶联免疫吸附试验
用ELISA法测定促炎细胞因子TNFα、IL-6和IL-1β的水平。将细胞刺激实验的培养基转移到ELISA板上，并使用制造商的方案测量水平。对于大脑和脾脏ELISA，在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中溶解速冻海马或脾脏组织，并在14000 rpm、4°C下离心10 min以去除任何不溶物。然后将上清液转移到ELISA板上，根据制造商协议测量细胞因子水平并取平均值（±SD）。
MTT还原分析
用MTT还原法测定细胞活力。在存在或不存在FK506或tat-VIVIT的情况下，用Aβ刺激细胞24小时后，在37°C下用0.1 mg/mL MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵）处理细胞4小时。抽吸培养基并用异丙醇溶解甲醛沉淀。在560 nm处测量光密度，取平均值（±SD）并绘制。
吞噬试验
为了测定Aβ刺激的小胶质细胞在NFAT抑制剂存在或不存在的情况下的吞噬能力，将小胶质细胞镀在96周的培养板上，然后未经处理或用1μM FK506处理24小时。然后用500 nM FITC-共轭Aβ1-42纤维或0.25 mg/mL FITC-偶联生物微粒处理细胞6小时。培养后，去除培养基，用0.25%台盼蓝冲洗细胞外肽或膜结合生物颗粒，使其荧光熄灭。使用荧光板阅读器测量吞噬肽和生物颗粒的荧光强度（480 nm激发和520 nm发射）并平均（±SD）。
动物治疗
NFAT抑制剂FK506、tat-VIVIT和tat-VEET在12个月大的雄性APP/PS1小鼠皮下注射。化合物通过微型渗透泵输送（型号1004，28天0.11μL/h输送速率，美国加利福尼亚州库比蒂诺市阿尔泽特）。任一车辆交付的泵（DMSO/HEPES）(n个 = 8） ，FK506（1 mg/kg/天）(n个 = 7） ，VIVIT（0.5 mg/kg/天）(n个 = 8） ，或阴性对照扰民肽，VEET（0.5 mg/kg/天）(n个 = 8） ，持续28天。在输注期结束时，对小鼠进行行为测试（28天输注中的第28天），然后对其实施安乐死并用PBS-CaCl灌注2，并迅速收集大脑和脾脏。对照组未经治疗的APP/PS1小鼠在相当的完成年龄（13个月）时收集(n个 = 6). 大脑右半球固定在4%多聚甲醛中，左半球在液氮中快速冷冻以进行生化分析。
蛋白质斑点
从对照组、经车辆处理或抑制剂处理的小鼠的左脑半球中分离出颞叶皮层，并进行溶解、在RIPA缓冲液中进行声波检测，然后使用Bradford方法进行定量[81]。裂解产物在10%SDS-PAGE上溶解，并转移到聚偏二氟乙烯膜上，以使用用于装载对照物的抗APP、抗BACE、抗突触素、抗PSD95、抗pNFκB（p65）和抗pNFATc2抗体以及抗α-微管蛋白、NFκ的B（p65%）和NFATc1（pNFATc 2）抗体进行Western blotting。使用Adobe Photoshop软件量化蛋白质印迹。带的光密度（O.D.）根据其各自的负载控制进行归一化，并取平均值（±SD）。
免疫组织化学
从未经治疗或NFAT抑制剂诱导的小鼠脑中采集的右半球固定在4%多聚甲醛中，并在30%蔗糖（0.1 M磷酸盐缓冲液）中冷冻保护，每3-4天更换蔗糖溶液至少三次。然后将固定组织包埋在15%的明胶基质中，将明胶块再次固定在4%多聚甲醛中3至4天，然后在30%蔗糖溶液中进行冷冻保护。然后使用干冰/异戊烷快速冷冻块，并在冷冻切片机上连续切割（40μm）。使用抗Aβ（4G8）和抗CD68（巨噬细胞/小胶质细胞标记物）抗体，以载体VIP为染色原，进行连续切片免疫染色。为了定量免疫染色，在整个颞皮层区域连续拍摄了三个切片（间隔960μm）的×1.25照片。使用Adobe Photoshop软件测量每个脑切片海马的光密度。获得每个条件（五个条件）、每个大脑（每个条件六到八个大脑）和每个截面（每个大脑三个截面）的光密度值，求平均值（±SD）并绘制图表。
T型迷宫
按照Wenk的描述进行T迷宫分析[82]。简言之，在开始输注后的第28天，小鼠被放置在T迷宫的起始臂中，门被打开，让小鼠沿着树干走下并进入手臂。一旦一只老鼠用四只爪子进入一只手臂，它就会回到起始手臂。门关闭了30秒，然后抬起，鼠标可以自由移动，直到再次进入手臂。这一过程被重复了九次试验，并注意到小鼠进入的手臂选择。平均每只小鼠在每种条件下的交替次数（±SD）并绘制图表。
统计分析
数据以平均值表示 ± SD。使用Tukey-Kramer的单向方差分析计算统计显著性事后（post-hoc）比较并在以下情况下认为重要对数值均<0.05。
结果
小胶质细胞表达多种NFAT亚型
为了比较NFAT小胶质细胞和外周免疫细胞的表达，我们将原代小鼠小胶质细胞与人类T细胞系Jurkat进行了比较。基于人类和小鼠中的NFAT亚型都表现出多种不同的剪接模式，我们预计每种亚型都有不同的蛋白质表达模式[83]。正如预测的那样，Western blot分析表明Jurkat细胞表达多种分子量NFAT亚型（图). 虽然原代小鼠小胶质细胞也显示出可检测到大量分子量物种，但只有NFATc1、NFATc2和NFATc4可检测到，而NFATc3不可检测到（图).
小胶质细胞表达多种NFAT亚型。小胶质细胞作为出生后第0天C57BL6/J小鼠的混合胶质细胞培养物生长，并在第14天纯化在体外使用抗NFATc1、c2、c3、c4、α-微管蛋白和ERK-2（负荷控制）抗体，通过Western blot将小胶质细胞（M）的裂解物与Jurkat人T细胞系（J）的裂解液进行比较。每个NFAT亚型的多条带可能反映了每个亚型报告的多个替代转录物。印迹是三个独立实验的代表。
刺激后细胞因子分泌增加需要小胶质细胞NFAT活性
为了确定改变小胶质细胞中的蛋白质表达是否需要增加NFAT活性，我们接下来收集了在不存在或存在tat VIVIT或FK506处理的情况下用Aβ或LPS刺激24小时的小胶质细胞的培养基，以抑制NFAT[70,73]。从培养基中进行TNFα和白细胞介素-6（IL-6）ELISA，以量化细胞因子分泌的任何变化。虽然Aβ单独治疗预期细胞存活率略有下降，但tat-VIVIT和FK506均未进一步降低存活率（图). 另一方面，tat-VIVIT和FK506均显著减弱了Aβ和LPS刺激的两种细胞因子的分泌（图).
FK506和tat-VIVIT可减弱小胶质细胞分泌Aβ刺激的TNFα。在不存在或存在1μM FK506或10μM tat VIVIT的情况下，用10μM Aβ1-42原纤维刺激小胶质细胞24小时。（A）取培养基等分样品，进行ELISA以定量分泌的TNFα水平。（B）还取培养基进行LDH释放分析，以量化细胞死亡。条件重复8次并取平均值（±SD）。图是三个独立实验的代表(*对 < 0.001）。
NFAT激活增加小胶质细胞对纤维Aβ的摄取
减少小胶质细胞的促炎性分泌可能是AD脑的有利条件，但同时吞噬能力的降低可能导致纤维Aβ斑块沉积的不良增加。为了确定NFAT抑制是否减弱小胶质细胞通过吞噬细胞摄取清除纤维Aβ的能力，用FK506刺激小胶质细胞，并量化FITC-结合的Aβ1-42纤维的摄取。与FK506治疗对细胞因子分泌的抑制作用相反，药物治疗实际上增加了Aβ纤维的吞噬细胞摄取（图). 此外，这不仅限于Aβ。FK506治疗后，FITC-标记生物颗粒的吞噬作用也增加，这表明这种益处并不特定于特定的颗粒类型（图).
FK506刺激Aβ原纤维的小胶质细胞摄取增加。在没有或存在1μM FK506的情况下，将小胶质细胞电镀24小时。将500 nM FITC-共轭Aβ1-42原纤维或0.25 mg/mL FITC-偶联生物微粒添加到细胞中，再持续6 h。孵育后，去除培养基，用台盼蓝淬灭来自非吞噬细胞肽的信号。使用荧光板阅读器定量吞噬肽和生物颗粒的荧光强度（480-nm激发和520-nm发射），并平均（±SD）。每个条件重复八次，图表代表三个独立实验（±SD）(*对 < 0.001来自对照，#
对 < 0.05来自Aβ，%
对 < 0.001来自生物粒子）。
NFAT抑制减弱Aβ纤维刺激的小胶质细胞介导的神经元死亡在体外
抑制NFAT治疗AD的另一个明显优势是神经保护的证据。为了证明小胶质细胞NFAT抑制是否可以提高AD患者的神经元存活率，我们接下来在不含或不含FK506的情况下刺激含有或不含Aβ纤维的小胶质细胞，并将该条件培养基转移到初级皮层神经元培养物中。我们之前的工作已经证明，与非刺激小胶质细胞培养基相比，这种Aβ刺激的条件培养基对神经元培养具有潜在的毒性[84]。用FK506治疗小胶质细胞可减轻Aβ刺激条件培养基的毒性（图). 重要的是，这种神经保护是通过小胶质细胞抑制实现的，因为在Aβ刺激的条件培养基存在的情况下直接向神经元添加FK506没有提供保护的能力（图).
FK506可防止Aβ刺激后小胶质细胞产生神经毒性条件培养基。在没有或存在表面结合的Aβ1-42纤维（48μmole/mm）的情况下刺激小胶质细胞48小时2)以及0.1和1μM FK506。将来自单独结合Aβ孔（阴性对照）、仅小胶质细胞孔（小胶质细胞CM）和Aβ刺激的小胶质细胞孔+/-FK506的条件培养基转移至7天在体外小鼠皮层神经元原代培养72h。此外，将FK506（0.1和1μM）直接添加到神经元（阴性对照）和神经元以及Aβ刺激的小胶质细胞。将神经元固定并用抗MAP2抗体染色，对存活细胞进行计数和平均（±SD）。刺激分两次进行，重复三次。结果是三个独立实验的平均值(*对 < 0.001）。
Tat-VIVIT和FK506减轻阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的微胶质增生
为了测试NFAT抑制特别是小胶质细胞活化的效果体内，我们接下来依赖于具有强大微胶质增生症的AD转基因小鼠模型[80]。使用APP/PS1转基因AD小鼠模型，我们测试了NFAT抑制对AD的治疗效果。APP/PS1小鼠通过微型泵，用FK506或脑渗透NFAT抑制肽tat-VIVIT治疗28天。对小胶质细胞标记物CD68的免疫染色表明，FK506和tat-VIVIT都可以，但阴性对照肽tat-VEET不能[74]，如预测的那样，小鼠海马中的CD68免疫反应显著减弱（图).
FK506和tat-VIVIT降低APP/PS1小鼠的CD68免疫反应性。12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、切片并使用抗CD68抗体对大脑进行染色，并从海马的连续切片中量化染色强度。获得每个条件（五个条件）、每个大脑（每个条件六到八个大脑）和每个截面（每个大脑三个截面）的光密度值，求平均值（±SD），并绘制(***对 < 0.001).
Tat-VIVIT和FK506降低阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的Aβ斑块负荷
为了确定小胶质细胞抑制是否导致这些小鼠的斑块负荷发生任何变化，使用抗Aβ抗体4G8对小鼠海马连续切片上的Aβ免疫反应性斑块进行染色。对牙菌斑密度进行量化，以揭示FK506和tat-VIVIT均能减轻Aβ肽含量的牙菌斑负荷（图). 这表明，通过NFAT抑制降低反应性小胶质细胞表型也有减少斑块负荷的额外有利作用。
FK506和VIVIT降低APP/PS1小鼠的Aβ斑块负荷。12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照杂化肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、切片并使用抗Aβ（4G8）抗体对大脑进行染色，并从海马的连续切片中量化染色强度。获得每个条件（五个条件）、每个大脑（每个条件六到八个大脑）和每个截面（每个大脑三个截面）的光密度值，求平均值（±SD），并绘制(***对 < 0.001).
Tat-VIVIT和FK506降低阿尔茨海默病转基因小鼠模型外周细胞因子分泌
接下来，使用这些小鼠的大脑和脾脏测量NFAT活性和细胞因子水平的变化，以确定小胶质细胞和Aβ斑块免疫反应性的降低是否与FK506或tat-VIVIT治疗后NFAT活性的实际降低和抗炎作用相关。虽然FK506显著降低小鼠脾脏中的IL-6、TNFα和IL-1β水平，但tat-VIVIT治疗仅显著降低IL-6和TNFα水平（图). 出乎意料的是，tat VIVIT或FK506治疗对脑细胞因子水平没有影响（图)尽管在脾脏中观察到了变化（图)并且观察到小胶质细胞免疫反应显著降低（图). 这表明，为了实现可量化的大脑抗炎、NFAT抑制作用，可能需要更高浓度的两种药物。
FK506和tat-VIVIT降低APP/PS1小鼠的脾细胞因子水平。12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、裂解脾脏并用于TNFα、IL-1β和IL-6 ELISA。(*对 < 0.05, **对 < 对照组0.01；$
对 < 0.01,$$
对 < 0.01来自车辆+对 < 来自VIVIT的0.05&&对 < 0.01来自FK506）
FK506和tat-VIVIT对APP/PS1小鼠的脑细胞因子水平没有影响。12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。收集、裂解海马并用于TNFα和IL-6 ELISA。
为了继续表征tat-VIVIT或FK506治疗对大脑的影响，我们进行了Western blot分析，以量化NFAT抑制剂治疗引起的任何其他差异。虽然NFATc1活性在治疗组之间没有差异，但其他NFAT亚型可能受到治疗的影响。通过测量磷酸化状态的任何变化来量化NFATc2的活性水平。然而，与NFATc1类似，治疗未导致活性、非磷酸化NFATc2增加（附加文件1：图S1）。为了确定Aβ斑块水平的降低是否是由于APP或其加工水平的改变，对APP和BACE进行了量化。同样，在任何治疗中均未观察到差异（附加文件1：图S1）。为了检测其他转录因子的变化是否与我们观察到的影响相关，还检测了c-Fos和磷酸化、活性p65 NFκB的蛋白水平。然而，与NFATc2类似，各组之间没有观察到差异（附加文件1：图S1）。最后，通过量化突触前标记物突触素和突触后标记物PSD95的蛋白水平来评估突触变化。各组之间未观察到差异（附加文件1：图S1）。
FK506和tat-VIVIT不能改善APP/PS1小鼠的空间记忆
为了确定NFAT抑制介导的小胶质瘤减少是否对APP/PS1小鼠的行为有影响，我们进行了T迷宫分析来量化工作记忆。注射tat-VIVIT或FK506的小鼠在T迷宫上的表现没有任何变化，这是通过T迷宫臂之间的交替次数来测量的（图).
FK506和tat-VIVIT没有改善APP/PS1小鼠的空间记忆。12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 6至8/条件）。在第28天使用小鼠进行T迷宫测试。对自发交替次数进行平均并绘制图表（±SD）。
讨论
总之，这些结果表明小胶质细胞表达多种NFAT亚型，它们在调节aβ刺激的细胞因子分泌增加中起作用。重要的是，用tat-VIVIT或FK506抑制NFAT足以减弱细胞因子分泌和神经元死亡，但增加Aβ吞噬细胞的摄取在体外同样，向APP/PS1小鼠外周注射tat-VIVIT或FK506可降低大脑中反应性小胶质细胞和Aβ免疫反应性斑块负荷水平。然而，这与大脑NFAT活性或细胞因子水平的变化无关。这些发现表明，开发特异性NFAT抑制剂，可能不依赖于穿越血脑屏障的能力，可能有希望减轻AD中发生的微胶质增生和Aβ沉积。
我们的研究结果与许多其他报告一致，这些报告表明NFAT活性是AD的合理抗炎靶点。从AD脑海马中发现，包括IL-1β、TNFα和GM-CSF在内的多种细胞因子水平升高，与NFAT1（NFATc2）的核蓄积相关[85]。此外，在皮层注射VIVIT后，APP/PS1中的NFAT抑制可减轻Aβ介导的神经毒性[41]。我们发现，小胶质细胞NFAT在调节病变大脑复杂的炎症环境中也很重要。未来的工作可能会确定一种细胞类型与另一种细胞中NFAT的特定亚型在预防炎症变化方面是否更有效。
虽然我们已经证明FK506和tat-VIVIT能够有效对抗Aβ介导的小胶质细胞效应在体外并且可以减轻APP/PS1线中的微胶质增生，我们认为这两种药物都不是NFAT亚型选择性药物。事实上，FK506具有抑制钙调神经磷酸酶活性的额外混淆[86]。因此，我们不能排除FK506治疗中观察到的一些变化是由于钙调神经磷酸酶抑制所致的可能性。事实上，其他一些人已经报道了钙调神经磷酸酶抑制在AD小鼠模型中的临床前益处[22,42,87-91]。我们的目的是对比tat-VIVIT治疗和FK506治疗的效果，因为VIVIT肽没有报道抑制钙调神经磷酸酶的能力[73,92,93]。通过这种方式，我们预测，在某种程度上，可以确定抗炎作用的多少是由于钙调神经磷酸酶对NFAT的抑制。此外，重要的是要指出，我们在在体外实验可能是由于aβ治疗本身的活性丧失所致。然而，VIVIT肽治疗对TNFα分泌的剂量依赖性抑制作用仍然存在，尽管aβ治疗在所有条件下都有类似的减少。然而，未来的工作需要将肽的无毒浓度降低到10μM以下，以防止我们观察到的毒性混淆。
我们的FK506和tat-VIVIT用于体内实验不是最佳的。例如，尽管FK506和tat-VIVIT肽都能降低脾脏外周细胞因子水平，但我们在大脑中没有观察到相同的变化。事实上，两种FK506的浓度都要高得多[88,90]和VIVIT肽[41,63,75]实现大脑效应。虽然FK506的剂量为1 mg/kg/天，与我们的剂量相似，但在τ病小鼠模型中用于减轻海马萎缩和微胶质增生[94]，其他人报告称，使用更高浓度的FK506（10至100毫克/千克/天）可以改善认知功能和脊柱密度恢复[88,90]。类似地，显示VIVIT在抑制Aβ介导的神经退行性变方面的作用的研究涉及病毒载体在皮层或海马中过度表达VIVIT，其局部浓度可能比我们的范式高得多[41,63]。一项类似于我们自己的研究，使用肽而不是VIVIT的表达系统，证明了NFAT在心脏肥大中的作用，并涉及皮下注射10 mg/kg剂量的VIVIT[75]。因此，我们获得的药物和肽的大脑浓度很可能不足以在我们的传递范式中抑制NFAT活性。这种可能性与我们无法量化FK506和tat-VIVIT融合小鼠大脑中活性NFATc2水平的任何降低这一事实相一致。在这种情况下，更高浓度的药物或肽或直接脑内给药可能会在未来的工作中实现更强大的抗胶质和抗炎作用。虽然不清楚更高浓度或更长时间给药VIVIT肽会产生什么不良影响，但很明显，更高剂量的FK506、，包括先前啮齿动物研究中使用的水平，可能对啮齿动物和人类产生一系列不利影响，尤其是肾毒性[87,91]。值得注意的是，尽管NFAT活性或脑细胞因子水平没有定量下降，但FK506和tat-VIVIT肽的浓度仍然显著降低小鼠的微胶质增生和斑块负荷。我们认识到，我们通过Western blot基于磷酸化变化间接评估NFATc2活性变化的方法并不是评估结合能力变化的最敏感或最可靠的方法。未来使用电迁移分析的工作无疑将为外围和大脑的活动变化提供更清晰的指示。我们推测，斑块负荷减少的一个可能原因是通过增加小胶质细胞吞噬能力提高了大脑的清除率。这表明了一种挑衅性的可能性，即外周细胞因子水平的适度变化和NFAT抑制可能足以对大脑产生显著的影响。这一想法的进一步扩展将是确定外周NFAT活性和由此产生的细胞因子或免疫细胞行为的调节是否足以限制大脑炎症。甚至可以说，外周NFAT抑制足以限制血液源性免疫细胞渗入大脑，从而最大限度地减少外周白细胞流入引起的炎症反应的恶化。事实上，先前的研究表明NFATc2在调节胶质母细胞瘤侵袭方面特别重要[85]。外周NFAT靶向策略可能会消除或减少对特定脑部抗炎药的需求，从而实际需要脑部穿透。
无论FK506或tat-VIVIT治疗导致微胶质增生和斑块负荷减少的确切机制如何，令人惊讶的是，这并没有通过T迷宫测试改善性能。我们采用的测试范式可能不够敏感，无法检测到因我们观察到的斑块负荷适度减少而导致的行为变化。额外的记忆测试方案和更长时间或更强健的药物方案可能会在小鼠模型中产生可量化的变化。
结论
这些数据支持Aβ介导的微胶质增生和细胞因子分泌在一定程度上受NFAT活性调节的观点。进一步研究以确定FK506和tat-VIVIT的适当剂量和治疗模式，以及确定新型脑渗透NFAT抑制剂，可能为限制AD的炎症成分提供一种治疗方法。
致谢
这项工作得到了BrightFocus Foundation A2012115、NIH 1P20 RR17699、NIH 2R01AG026330和NIH 1R01AG042819的支持。
其他文件
附加文件1：图S1。（360万，tiff）FK506和tat-VIVIT没有改变APP/PS1小鼠的脑蛋白水平或活性NFATc2水平。12个月大的雄性APP/PS1小鼠通过皮下给药治疗28天，无需治疗（对照组）、载体二甲基亚砜、1 mg/kg/天FK506、0.5 mg/kg/日VIVIT或0.5 mg/kg/天阴性对照扰民肽、VEET(n个 = 4/条件）。采集颞叶皮层，用SDS-PAGE进行裂解和分离，并用抗APP、BACE、PSD95、突触素、pNFATc2、NFATc1（负荷控制）、抗pNFκB（p65）、抗NFκ的B（p55）（负荷控制）、c-Fos和βIII微管蛋白（负荷控控）抗体进行免疫印迹。根据各自的负载控制标准化光密度，求平均值，并绘制图表（±SD）。
脚注
竞争性利益
作者声明，他们没有相互竞争的利益。
作者的贡献
LR、AMF、GDM和CKC构思、执行和解释了实验。LR、GDM和CKC编写并修订了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
工具书类
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