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.2015年5月22日；290(21):12984-98.
doi:10.1074/jbc。M114.633891。 Epub 2015年4月6日。

细胞动力学失败诱导的四倍体发育为非整倍体，引发磷蛋白缺乏小鼠的皮肤老化

田中弘子 1, Hidemasa Goto先生 2, 明仁仁子 1, Hiroyuki Makihara公司 三, Atsushi Enomoto公司 4, Katsuhisa Horimoto公司 5, 松山真本 1, 黑田贤一 6, 岩泽一郎 1, 稻垣正树 7
附属机构

细胞动力学失败诱导的四倍体发育为非整倍体，引发磷蛋白缺乏小鼠的皮肤老化

田中弘子等。 生物化学杂志. .

摘要

四倍体是一种细胞染色体加倍的状态，在～20%的实体肿瘤中观察到，并被认为在致癌过程中常先于非整倍体。在终末分化期间也检测到四倍体，这是衰老的标志。大多数四倍体培养细胞被p53稳定化阻止。然而，四倍体细胞在体内的命运仍基本未知。在这里，我们分析了磷酸波形蛋白缺乏（VIM（SA/SA））小鼠皮肤修复伤口的能力。伤口愈合早期，皮下成纤维细胞未能进行胞质分裂，导致双核四倍体。因此，p21（p53应答基因）的mRNA水平以VIM（SA/SA）特异性方式升高。四倍体的消失与非整倍体的增加相一致。此后，VIM（SA/SA）小鼠的衰老相关标记物显著升高。由于我们的四倍体小鼠模型在14个月大时也表现出皮下脂肪丢失，这是另一种早衰表现，我们的数据表明，在细胞因子衰竭后，一部分四倍体细胞进入新的细胞周期，并在体内发育成非整倍体细胞，从而促进早衰。

关键词：老化；非整倍体；胞质分裂；中间丝；磷酸化；皮肤；四倍体。

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数字

图1。
图1。
有丝分裂波形蛋白磷酸化缺陷小鼠的皮肤组织(VIM公司南非/南非). A类和B类，每张照片都显示了3个月或14个月大的小鼠背部皮肤的H&E染色(A类). 我们计算了指定日期受影响区域皮下成纤维细胞的平均数量，每个伤口使用100多个H&E切片(B类). 数据表示每350×260μm伤口面积皮下成纤维细胞的平均±S.E(n个＝每个基因型在3个月龄或14个月龄时分别有6或3只小鼠；B类).C–F，每张照片都显示了背部皮肤的Picro天狼星红染色。胶原纤维染色红色(C类). 我们计算了背部皮肤皮下胶原蛋白或脂肪层的平均厚度，每只小鼠使用20多个切片；数据表示三个独立实验（*，第页<0.05，双尾吨测试；D–F型).G公司放大的H&E图像显示背部皮肤中的脂肪细胞。H（H）使用实时RT-PCR定量背侧皮肤上指示基因的mRNA数量，将其归一化为GAPDH mRNA的数量，并表示为VIM公司南非/南非老鼠。数据表示四个独立实验的平均值±S.E。比例尺=500微米(A类,上部面板)，200微米(A类,下部面板和C类)和10μm(G公司).未注明日期。，没有检测到信号。***，第页< 0.001).
图2。
图2。
VIM公司南非/南非小鼠体重减轻，但肝脏、肾脏和肠系膜无任何表型。 A–D，雄性或雌性小鼠的体重(n个=10）或雄性小鼠的每个组织重量(n个=5）。E类，每张照片都显示了腹部器官和肠系膜的大体外观。肝脏和肠系膜脂肪组织也用H&E染色。个人简历表示肝脏中央静脉。比例尺，50微米*，第页< 0.05.
图3。
图3。
VIM公司南非/南非小鼠的心血管系统没有异常。 A–C、心脏重量、最大左心室直径(LVD（LVD）)或使用每组雄性小鼠测量腹主动脉中膜厚度(n个= 5).D类心脏和腹主动脉中膜用H&E染色。加利福尼亚州表示心脏有冠状动脉。比例尺，1000微米(D类,上部面板)，50微米(D类,中间面板)和200μm(D类,下部面板).
图4。
图4。
延迟伤口修复VIM公司南非/南非老鼠。 A类和B类背部皮肤损伤后伤口闭合过程的时间进程。这个图表显示皮肤损伤后指定天数内剩余受影响面积的百分比；第0天的面积设置为100%(B类).C类和D类，每张照片显示受伤后指定天数背部皮肤的H&E染色(C类). 我们计算了受影响区域皮下成纤维细胞的平均数量，如图1图例所示(D类).E类和F类，伤后7、15天皮下组织创面用抗Ki67染色(E类). 我们计算了指定日期受影响区域Ki67阳性成纤维细胞的平均比例，每个伤口使用20多个切片；数据表示六个独立实验的平均值±S.E(F类).比例尺，1000微米(A类)，500微米(C类，低倍率）和50μm(C类高倍放大，以及E类). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图5。
图5。
创伤修复过程中皮肤成纤维细胞和上皮细胞的功能障碍VIM公司萨/萨老鼠。 A–E，每张照片都是皮克罗-天狼星-红(A类)，抗角蛋白6(B类)，抗角蛋白1(D类)，或抗角蛋白14(E类)伤区中央背侧皮肤染色。我们计算了抗角蛋白6的相对强度，每个小鼠使用20多个切片(C类). 数据显示为VIM公司南非/南非小鼠在受伤后的每一天，代表六个独立实验的平均值±S.E.。***，第页< 0.001.比例尺，200微米。
图6。
图6。
多核、IF-桥和额外中心体的形成VIM公司南非/南非创面愈合早期的成纤维细胞。 A类和B类伤后组织切片用抗波形蛋白染色(绿色)和DAPI(蓝色). 免疫荧光显微照片VIM公司重量/重量受伤后第7天的老鼠是典型的样本(A类).白色圆点和黄色虚线分别表示为伤口和未受影响（正常）区域之间以及表皮和真皮之间的边界(A类). 缠绕边缘的位置也标记为箭头(A类). 我们计算了伤口区域与邻近未受影响（正常）区域抗波形蛋白强度的比值，每个伤口使用10个切片(B类). 数据表示三个独立实验的平均值±S.E(B类). 1:1的比率表示为绿线在图表中(B类).C–F类，免疫组织化学(C类)或免疫荧光(D类)伤后第3天受影响区域的图像。箭头或箭头在里面C类分别表示具有IF-桥（连接两个子细胞）或两个细胞核的成纤维细胞。箭头在里面D类表明成纤维细胞中存在γ-微管蛋白斑点。我们计算了具有双核的皮下成纤维细胞的百分比(E类)或三个以上γ-微管蛋白斑点（中心体；F类)在指定的日期，每个伤口使用10个以上的切片。数据表示三个独立实验的平均值±S.E(E类和F类).比例尺，500微米(A类)，10微米(C类)和5μm(D类). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图7。
图7。
详细分析来自新生小鼠背部皮肤的原代培养细胞。 A–J，小鼠新生皮肤的原代成纤维细胞(A–D和G–J型)或小鼠胚胎成纤维细胞(E类和F类)进行免疫染色(A类,B类,我、和J型)，免疫印迹(C–F类)，或FISH(G公司和H（H）).C类、U251（人脑胶质瘤）、HeLa（人宫颈癌）或幼仓鼠肾脏(必和必拓)细胞作为阳性对照，分别检测胶质纤维酸性蛋白、HSP70或结蛋白。D类，相间(我)或有丝分裂(M（M）)按照“实验程序”中的描述制备细胞裂解物，然后进行锰处理2+-荧光标记SDS-PAGE，然后进行免疫印迹。磷酸化波形蛋白(pVim公司)迁移速度慢于波形蛋白，无磷酸化(维姆)由于磷酸根与锰的相互作用2+-磷标记改性聚丙烯酰胺。E类，上清液(S公司)和颗粒(P（P）)有丝分裂MEF的组分按照“实验程序”进行制备。GAPDH或组蛋白H3的量(HH3型)也进行了监测，以评估分馏。F类，免疫沉淀的波形蛋白(IP（IP）)对MEFs进行免疫印迹。同样的实验程序也在没有任何细胞作为阴性对照的情况下进行(仅Ab). 安星号或箭头分别表示IgG重链或波形蛋白的位置。G公司,绿色或红色代表小鼠染色体上的斑点(变更。)分别为12或19。带有IF-桥的细胞百分比(B类)或超过两个主轴极(J型)每次实验至少使用20个细胞进行计算。数据表示三个独立实验的平均值±S.E(B类和J型).比例尺，10微米(A类和G公司)和5微米(我). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图8。
图8。
创伤愈合后期非整倍体和衰老成纤维细胞的出现VIM公司南非/南非老鼠。 A类和D类，照片显示了皮肤损伤后指定天数受影响区域成纤维细胞核的FISH分析。受伤后第15天每种基因型小鼠的照片显示为代表性样本(A类). 这个图表显示非整倍体成纤维细胞的百分比(n个=每个基因型10个片段；D类).B类,C类,E类、和F类伤后0、9或15天组织切片用抗γ-H2AX染色(B类)或抗β-半乳糖苷酶（β-半乳糖苷;C类). 我们计算了γ-H2AX的百分比(E类)-或β-gal(F类)-受影响区域的成纤维细胞呈阳性，每个伤口至少使用10个切片。数据表示三个独立实验的平均值±S.E(E类和F类).比例尺，10微米(A类)和50微米(B类和C类). ***,第页< 0.001.
图9。
图9。
衰老标记物在VIM公司南非/南非小鼠伤口愈合期间。 A类和B类，如图1F图例所示，使用实时RT-PCR对受影响区域的指示基因的mRNA数量进行量化。数据以VIM的倍数表示重量/重量小鼠在损伤后指定日比较基因型差异(A类)或作为折叠VIM公司南非/南非小鼠损伤前（第0天）mRNA表达的时间进程分析VIM公司南非/南非老鼠(B类).C、，根据图6中的数据判断，E类和F类, 8,D–F型、和9B类，皮肤损伤后每种现象的时间过程示意为曲线。每种现象的峰值表示为100%。D类，scheme表示我们的工作假设。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
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